2021年腦缺血k選修精品資料PPT

1、2021年腦缺血k選修精品資料PPT2021年腦缺血k選修精品資料PPT第一節(jié) 概述腦缺血是一種常見病，已成為引起人類死亡的第三大原因。引起腦缺血的原因很多。腦缺血可導致許多病理生理改變。2第一節(jié) 概述腦缺血是一種常見病，已成為引起人類死亡的第三大短暫性的局灶性腦缺血，往往引起缺血中心部位的梗死。梗死區(qū)（core）的細胞表現(xiàn)為水腫和壞死。梗死的邊緣區(qū)又稱為半影區(qū)（penumbra）。隨著缺血程度的加重或缺血時間的延長，半影區(qū)的神經元損傷也隨之加重，甚至導致繼發(fā)性死亡，使原有的梗死區(qū)進一步擴大。 通常講的腦保護效應，主要是指對梗死的邊緣區(qū)神經元的保護。 概述3短暫性的局灶性腦缺血，往往引起缺血中

2、心部位的梗死。概述5腦缺血損害病灶圖示a腦缺血閾值和腦缺血損害程度b缺血半帶和中心區(qū)4腦缺血損害病灶圖示a腦缺血閾值和腦缺血損害程度b缺血半帶一、缺血的腦組織病理學 組織學的改變應當發(fā)生在生化改變之后，但在腦缺血數(shù)分鐘之后即可見到某些形態(tài)學改變。 神經細胞的改變早于星形細胞和內皮細胞。 線粒體水腫及嵴結構紊亂，胞漿中出現(xiàn)小空泡，此即早期的神經元小空泡形成階段 ，水腫使離子梯度喪失。此時立刻恢復再灌流仍是可逆的。 隨著缺血加重，細胞皺縮、核移位、細胞染色加深。最后染色質積聚、微管斷裂、核蛋白彌散、細胞周圍出現(xiàn)電子致密層。 5一、缺血的腦組織病理學 組織學的改變應當發(fā)生在生化改變之后，缺血后細胞水

3、腫6缺血后細胞水腫8神經元選擇性易受累。 一些選擇性容易受損的細胞群，在全腦缺血后進行再灌流，有些部位如海馬CA1、CA3、CA4區(qū)的錐體細胞和紋狀體的中、小細胞所受損害較別的地方嚴重，小腦Purkinje細胞和大腦皮層的第3、5、6層神經細胞也較容易受損，膠質細胞則保持良好；同時這些神經元中有一些容易出現(xiàn)遲發(fā)的自溶趨向，它們在灌流后當時功能和形態(tài)均完好，而數(shù)小時至數(shù)日后出現(xiàn)自溶。7神經元選擇性易受累。 9大鼠全腦缺血損傷海馬區(qū)Nissl染色法 A, B缺血組; C, D正常對照組8大鼠全腦缺血損傷海馬區(qū)Nissl染色法 A, B缺血組; 大鼠海馬CA1區(qū)缺血/再灌注GFAP及nestin染色

4、圖片 9大鼠海馬CA1區(qū)缺血/再灌注GFAP及nestin染色圖片 二、腦梗死的臨床表現(xiàn) 腦梗死（cerebral infarction）是指由于腦部血液供應障礙，缺血、缺氧引起腦組織壞死。臨床上常見的有動脈血栓性腦梗死、腦栓塞 。動脈血栓性腦梗死多見于50-60歲以上患有動脈硬化的老年人。有報告在65-74歲年齡組發(fā)病率達每年1，男性稍多于女性，常伴有高血壓、冠心病、糖尿病。多于靜態(tài)突然發(fā)病，常在數(shù)分鐘到數(shù)小時，甚至1-2天達高峰。通常意識清楚，生命體征平穩(wěn)，但當大腦半球較大區(qū)域梗死或基底動脈閉塞病情嚴重時，意識可不清，甚至出現(xiàn)腦病，引起死亡。 10二、腦梗死的臨床表現(xiàn) 腦梗死（cerebr

5、al infarc11131臨床類型 （1）完全性 （2）進展性 （3）可逆性腦缺血發(fā)作或稱可逆性缺血性神經功能缺損 121臨床類型 142.不同動脈閉塞時的臨床表現(xiàn)由于血栓形成的部位不同，出現(xiàn)相應動脈支配區(qū)的神經功能障礙。 大腦中動脈是頸內動脈的直接延續(xù)，供應大腦半球血流量的80左右，供應大腦半球背外側面的2/3和尾狀核、豆狀核。是血栓形成與腦栓塞的好發(fā)部位。 大腦中動脈主干閉塞：表現(xiàn)為對側偏癱、偏身感覺障礙和偏盲。 132.不同動脈閉塞時的臨床表現(xiàn)由于血栓形成的部位不同，出現(xiàn)相應1416三、研究常用實驗模型 （一）全腦缺血實驗模型1.蒙古沙土鼠全腦缺血模型 ：由于該動物大腦基底動脈環(huán)的畸形

6、，當雙側頸動脈結扎阻斷腦血供后椎動脈不能代償，而造成全腦缺血。 2.四動脈結扎全腦缺血模型：大鼠四動脈結扎，造成全腦血供障礙。 這兩種模型均用于模擬臨床上心臟驟停而造成全腦的短暫性缺血。 15三、研究常用實驗模型 （一）全腦缺血實驗模型17（二）局部腦缺血的模型 1.線栓法 ：通過頸內動脈插入顱內動脈，阻塞大腦中動脈的分叉入口處血流，造成大腦中動脈血供支配腦區(qū)的缺血?？蓪⒛猃埦€取出，造成缺血腦區(qū)血流的再灌注。此模型主要用于局部腦缺血再灌注神經元損傷的病理機制。 2.光化學腦栓塞局灶性腦缺血模型 ：動物靜脈內注入光敏劑，用立體定位儀在特定的腦區(qū)照射一定波長的冷光源，從而激活微血管內的凝血機制，引

7、起光照局部形成血栓。適用于一些溶栓藥物的腦保護作用的研究。 16（二）局部腦缺血的模型 18大鼠腦血管解剖示意圖（紅線表示栓線的插入位置）17大鼠腦血管解剖示意圖（紅線表示栓線的插入位置）19（三）離體實驗模型 離體的腦片及培養(yǎng)細胞結合給予低糖及低氧孵育、或化學試劑的處理均可以作為模型，可用于研究缺氧缺血性神經元死亡機制和藥物的保護作用。 18（三）離體實驗模型20第二節(jié) 急性缺血性神經細胞損傷及其死亡的機制 一、缺血致神經細胞膜電位及離子濃度的變化二、谷氨酸神經毒理論三、神經元的DNA氧化損傷 四、細胞因子對缺血性神經元的損傷作用五、缺血性神經元的凋亡及其調節(jié) 19第二節(jié) 急性缺血性神經細胞

8、損傷及其死亡的機制 一、缺血致神一、缺血致神經細胞膜電位及離子濃度的變化腦缺血引起能量供給障礙，很快引起神經細胞膜電位及細胞膜內外離子濃度的變化。在缺血后15-90秒之內，不同腦區(qū)的神經細胞膜電位變化不一，如海馬CA1和CA3區(qū)的神經細胞表現(xiàn)為先超極化，繼之去極化，而齒狀回的細胞則表現(xiàn)為去極化。 20一、缺血致神經細胞膜電位及離子濃度的變化腦缺血引起能量供給障實驗進一步證明了去極化是與K通道功能傳導增加有關。 在神經細胞缺氧的最初數(shù)分鐘內，細胞膜內外的大多數(shù)離子濃度差變化緩慢，但是K變化較為明顯，導致細胞膜產生去極化（-20mV），引起所謂的低氧性去極化反應（anoxic depolariza

9、tion）。 當缺氧達3-5分鐘時，細胞外K從3-9mM上升到50-80mM，伴細胞間隙中Na、Cl和Ca2的含量下降。此時細胞外Na為60-70mM，Cl75-90mM，Ca2 -0.1mM。 21實驗進一步證明了去極化是與K通道功能傳導增加有關。 23（一）鉀通道在缺氧性神經元損傷中的作用參與缺氧損傷神經元病理過程的主要鉀通道有ATP敏感鉀通道鈣依賴性鉀通道延遲外向鉀通道在缺氧性神經元損傷中鈣依賴性鉀通道的作用比較復雜，ATP敏感鉀通道開放對神經元具有保護作用，而延遲外向鉀通開放則導致神經元發(fā)生凋亡。 22（一）鉀通道在缺氧性神經元損傷中的作用24（二）鈉通道在缺氧性神經元損傷中的作用 電

10、壓依賴性鈉通道可介導瞬態(tài)鈉電流和持續(xù)鈉電流兩種鈉電流。在缺氧情況下，這兩種鈉電流的變化對缺氧性神經元損傷有截然相反的作用。 瞬態(tài)鈉電流降低對細胞可能具有保護作用。增加持續(xù)鈉電流將加劇細胞損傷。23（二）鈉通道在缺氧性神經元損傷中的作用 25（三）鈣通道在缺氧性神經元損傷中的作用Ca2+參與細胞表面生物電現(xiàn)象和細胞內的生化過程。Ca2+內環(huán)境穩(wěn)定，主要靠胞膜對Ca2+極低的通透性和依賴能量將鈣從細胞內主動排出（鈣泵）來維持。Ca2+的內流主要通過電壓門控性鈣通道和受體啟動的鈣通道，以及通過細胞內第二信使的內在機制和神經遞質的作用。 電壓門控性鈣通道可由受體啟動的鈣通道來調控，而后者N-甲基-D型

11、天冬氨酸（NMDA）受體也受電壓依賴活動的影響，細胞膜的Na+-Ca2+交換系統(tǒng)、線粒體膜鈣泵系統(tǒng)與內質網的運轉系統(tǒng)起了重要的調節(jié)作用。 24（三）鈣通道在缺氧性神經元損傷中的作用26腦缺血缺氧后能量衰竭，ATP生成不足，電壓門控性鈣通道開放，細胞內Ca2+增加。缺血后細胞間隙釋放增多的谷氨酸作用于NMDA受體，激活受體啟動的鈣通道，也引起Ca2+內流。細胞興奮時，細胞內腺苷酸環(huán)化酶的增加，鳥苷酸環(huán)化酶的降低，以及去甲腎上腺素的作用，使線粒體的Ca2+釋放，而已進入細胞內的Ca2+又激活細胞內貯存的Ca2+使細胞內Ca2+飽和。 25腦缺血缺氧后能量衰竭，ATP生成不足，電壓門控性鈣通道開放，

12、鈣內流的影響： 當腦血管平滑肌內的Ca2+上升至一定濃度時，導致血管平滑肌收縮使血管痙攣，從而更減少了缺血后腦組織的CBF，加重了缺血。 游離的Ca2+進入細胞內造成細胞內各種鈣依賴性酶反應被無秩地激活，使細胞膜的磷脂被分解，產生游離脂肪酸引起細胞膜受損；而游離脂肪酸更激活前列腺素系統(tǒng)，促進自由基產生，引起不可逆性細胞損害。 26鈣內流的影響： 28細胞內鈣超載是造成缺氧神經元進一步損傷和致死的重要環(huán)節(jié)。盡管大量的研究表明，細胞內鈣超載是缺血性神經元死亡的主要機制之一，但是早期的實驗并沒證明鈣通道拮抗劑具有明顯的神經元保護作用。其原因可能與藥物對離子通道蛋白的選擇性有關。 27細胞內鈣超載是造

13、成缺氧神經元進一步損傷和致死的重要環(huán)節(jié)。盡管二、谷氨酸神經毒理論（一）腦缺血致突觸間隙谷氨酸含量升高谷氨酸是中樞神經系統(tǒng)中主要的興奮性神經遞質。在正常情況下，谷氨酸在突觸間隙內的含量維持是依賴于突觸前膜的正常釋放和神經元與膠質細胞的再攝取過程來完成的。 突觸間隙谷氨酸含量升高反映多種可能性，即釋放增加或再攝取障礙，或兩者兼有之。 28二、谷氨酸神經毒理論（一）腦缺血致突觸間隙谷氨酸含量升高30（二）谷氦酸受體的興奮性與缺血性神經元死亡腦缺血引起谷氨酸在突觸間隙的堆積，從 而過度興奮谷氨酸受體導致神經元死亡。 谷氨酸受體的分類及其特性 離子型谷氨酸受體(ionotropic glutamate

14、receptors, or ligand-gated ion channels): NMDA（N-methyl-D-asparate）、AMPA（-amino-3-hydrosy-methyl-isoxazole-4-propionate）和KA（kainate）受體 代謝型谷氨酸受體（metabotropic glutamate receptors）：有8種亞型，為mGluR1-8 。29（二）谷氦酸受體的興奮性與缺血性神經元死亡31圖4-1 離子型及代謝型谷氨酸受體分類及其作用方式示意圖 30圖4-1 離子型及代謝型谷氨酸受體分類及其作用方式示意圖 31.代謝型谷氨酸受體：可分為三類：第一

15、類由mGluR1和mGluR5組成(激活PKC)；第二類由mGluR2和mGluR3組成；第三類由mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8組成。 mGluR分布于突觸前和突觸后膜上，功能研究表明，mGluR激動劑本身沒有明顯的神經細胞毒的作用，但可通過激活PKC的活性，調節(jié)離子型谷氨酸受體激動劑的毒性作用。 311.代謝型谷氨酸受體：332.離子型谷氨酸受體 （1）AMPA受體： AMPA受體在腦內分布廣泛，其分布區(qū)域與NMDA較一致。AMPA受體興奮后，主要參與突觸后膜興奮性電位的快速反應過程。當AMPA受體興奮時，其中GluR1、GluR3和GluR4亞單位參與細胞膜對鈣離子

16、的高通透性作用，而GluR2則相反。GluR2的存在具有抑制AMPA受體興奮所引起的鈣通道打開作用。 GluR2在腦內的分布量很高，并具有抑制鈣離子通道的通透作用。此外，藥物引起AMPA受體興奮時，該受體會產生快速的去敏反應。AMPA受體GluR2的這些生物學特性都有助于降低谷氨酸興奮性神經毒的作用。 322.離子型谷氨酸受體 34（2）KA受體：KA受體在中樞神經內分布較集中，僅分布于海馬、下丘腦和小腦顆粒細胞層等。KA受體由3個亞單位構成，它們分別是GluR5、GluR6和GluR7。由于缺少特異的KA受體激動劑或拮杭劑，因此對KA受體的功能研究相對較少。 33（2）KA受體：KA受體在中

17、樞神經內分布較集中，僅分布于海馬（3）NMDA受體：NMDA受體在腦內分布廣泛。在正常情況下，NMDA受體參與認知、學習和記憶功能。 NMDA受體由二組亞單位構成，即NR1和NR2， NMDA受體是以NR1和NR2復合形式行使其功能， NR1亞單位可能是NMDA受體發(fā)揮生物效應的必需結構蛋白，而NR2亞單位被認為是NMDA受體的調節(jié)蛋白。34（3）NMDA受體：NMDA受體在腦內分布廣泛。在正常情況下在NMDA受體上，至少有5個不同的調節(jié)部位，如NMDA受體激動劑谷氨酸結合部位（agonist glutamate binding site）、甘氨酸結合部位（co-agonist glycine

18、 binding site）、PCP結合部位、電壓依賴Mg2結合部位（voltage-dependent Mg2site）、Zn2+結合部位（Zn2+ site）。其中Mg2，Zn2+，PCP具有抑制NMDA受體興奮性作用，而甘氨酸則可增強NMDA受體激動劑的反應性 。 NMDA受體興奮后，打開配體門控離子通道，使細胞外鈣流入胞內，鈣的內流參與了NMDA受體興奮性傳遞作用，同時也是造成谷氨酸細胞毒的主要機制之一。35在NMDA受體上，至少有5個不同的調節(jié)部位，如NMDA受體激（4）谷氨酸受體阻斷劑在缺血性神經元損傷中的保護作用 在缺血性神經細胞死亡過程中，谷氨酸受體中以NMDA受體的作用最為突

19、出。采用NMDA受體競爭性和非競爭性拮抗劑，甘氨酸拮抗劑，多胺拮抗劑，二價離子如Mg2+和Zn2+均可以在不同程度上阻止缺血性神經元的死亡。 AMPA/KA受體拮抗劑在腦缺血神經元損傷中也具有神經保護作用。 36（4）谷氨酸受體阻斷劑在缺血性神經元損傷中的保護作用 38（三）谷氨酸載體參與缺血性神經元損傷病理反應 谷氨酸的代謝主要依賴谷氨酸載體的再攝取。腦缺血后，缺血邊緣腦區(qū)的神經細胞上谷氨酸載體再攝取活性增加，表達均增加，包括神經膠質和神經元，這很可能作為一種機體的自身保護機制參與該病理反應過程。 若采用藥物抑制谷氨酸載體的活性，或者用反義寡核苷酸阻斷谷氨酸載體的蛋白生物合成，則明顯地加劇腦

20、缺血后引起的神經元死亡和擴大缺血性腦梗死灶。 37（三）谷氨酸載體參與缺血性神經元損傷病理反應 39（四）谷氨酸興奮性神經毒的分子機制包括細胞受體離子通道、細胞內信號轉導系統(tǒng)、胞內核因子、DNA的修復過程等環(huán)節(jié)。 38（四）谷氨酸興奮性神經毒的分子機制40谷氨酸與NMDA受體結合后，打開Ca2+通道，使細胞外Ca2+進人細胞內可直接產生超氧陰離子(O2-)，Ca2+與鈣調蛋白（calmodulin, CaM）結合，一方面激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)活性，另一方面激活鈣神經素（calcineurin），后者使NOS去磷酸化進一步激活NOS，從而產生的N

21、O-，O2-和NO-結合形成ONOO-，后者可造成DNA損傷和抑制線粒體的呼吸鏈功能，產生ATP功能障礙，使細胞內一些ATP依賴泵功能障礙，同時使體內的自由基大量生成，尤其是羥自由基（OH），后者可攻擊核苷酸，造成DNA損傷。損傷的DNA激活PARS（poly ADP-ribosesynthase），加劇能量耗竭，最終導致神經元死亡。同時損傷的DNA可以激活細胞內的自身修復機制。當修復能力大于損傷時，細胞得以存活，反之，細胞則死亡。39谷氨酸與NMDA受體結合后，打開Ca2+通道，使細胞外Ca2圖4-2 谷氨酸神經毒作用機制示意圖 40圖4-2 谷氨酸神經毒作用機制示意圖 424143三、神經

22、元的DNA氧化損傷 大腦是人體所有臟器中代謝速率最高的器官，其代謝所需的能量主要由氧化代謝產生。然而，氧化代謝過程中會產生各種活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS），后者將攻擊細胞內的蛋白、脂質及核苷酸等成分，造成氧化應激損傷，其中以核苷酸或DNA損傷較為突出。 正常細胞代謝過程中產生的DNA損傷可以通過自身修復被完全消除。 在腦損傷或異常的情況下，DNA的氧化損傷程度加劇，大大超過自身正常的修復能力，造成神經細胞內損傷DNA的堆積，從而使細胞退化或死亡。 42三、神經元的DNA氧化損傷 大腦是人體所有臟器中代謝速率最高（一）自由基的正常代謝 自由基是指外層軌

23、道具有不配對電子的原子、原子團、離子和分子。自由基廣泛存在于各種生物體內，它異常活潑，可與生物大分子，特別是細胞膜上的不飽和脂肪酸反應，形成脂質過氧化物（LPO）破壞生物膜。生物體內的自由基以含氧自由基為主，主要包括：超氧陰離子（O2-）、羥自由基（OH）、單線態(tài)氧（1O2）、一氧化氮（NO）等。正常情況下腦組織清除自由基靠兩個方面，即酶和天然的抗氧化劑。 43（一）自由基的正常代謝 45（二）自由基參與缺血性神經細胞損傷的病理過程 腦缺血再灌注腦內產生大量自由基。其中OH是活性最高、毒性最大的一種自由基，而且其它多種自由基也可最終生成OH而發(fā)揮其毒性作用。 1.缺血損傷腦內自由基的生成途徑：

24、（1）黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)的活化：ATP 降解 次黃嘌呤黃嘌呤氧化酶 黃嘌呤+尿酸+O2- 此途徑是缺血再灌注后產生自由基的主要途徑，生成的O2-可以在金屬離子的催化下生成毒性更大的OH。 44（二）自由基參與缺血性神經細胞損傷的病理過程 46（2）花生四烯酸的代謝：膜磷脂 降解 花生四烯酸(AA)環(huán)氧化酶/脂氧化酶前列腺素(PGs)/白三烯(LTs)+O2- （3）NO途徑：鈣升高間接激活NO合酶的活性，生成NO。在缺血再灌中由于大量超氧化物的生成，NO可以與之反應 ，具有毒性。 （4）吞噬細胞的呼吸鏈代謝：吞噬細胞對氧的攝取量增加，細胞中NADPH氧化酶活性增高，將O2還原為O2- 。 （5）

25、其它：線粒體與微粒體可以將小部分的O2還原為O2- 。兒茶酚胺類遞質自身氧化的同時也形成自由基。 45（2）花生四烯酸的代謝：472.缺血損傷時腦內的DNA氧化損傷 在生理條件下，由于腦代謝過程中產生大量自由基ROS。后者通過DNA鏈間或DNA與蛋白質之間的交鏈反應，或通過對核苷酸堿基的化學修飾，從而使DNA鏈的單鏈和雙鏈斷裂，或糖苷鍵的裂解等造成細胞的DNA氧化損傷。 462.缺血損傷時腦內的DNA氧化損傷 48圖4-3 DNA氧化損傷產生的主要部位示意圖OH和活性氧簇攻擊鄰近DNA可形成：（1）攻擊堿基引起堿基損傷；（2）攻擊糖苷鍵產生AP位點損傷；（3）攻擊磷酸鍵引起DNA鍵斷裂，可發(fā)生

26、在3-OH末端（3a）或3-PO4末端（3b）；（4）攻擊核糖產生3-PG末端損傷 47圖4-3 DNA氧化損傷產生的主要部位示意圖49正常腦內每時每刻都有大量的DNA的損傷和修復的存在，大腦有強大的DNA的修復能力以及對DNA損傷的耐受性。短暫腦缺血后，腦內氧化DNA損傷可增加5倍以上，而DNA修復活性僅增加約3倍，再灌3小時后僅有85左右的氧化DNA損傷可被消除。因此，氧化DNA損傷的形成大大超過了DNA的修復能力，成為腦缺血性神經元死亡的病理原因之一。在體外實驗發(fā)現(xiàn)，ROS可以誘發(fā)氧化DNA損傷的類型約達100種。如果這類損傷得不到及時的修復，將在轉錄和復制過程中引起鏈延長終止或編碼屬性

27、的改變，則將造成神經細胞的退行性變或突變。48正常腦內每時每刻都有大量的DNA的損傷和修復的存在，大腦有強圖4-4 氧化應激損傷時腦內核苷酸損傷的常見類型 49圖4-4 氧化應激損傷時腦內核苷酸損傷的常見類型 51四、細胞因子對缺血性神經元的損傷作用細胞因子（cytokines）是一個存在體內自然產生的蛋白，包括白介素-1（interleukin-1, IL-1）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）等。它參與細胞的感染、炎癥、自身免疫、外傷或缺血損傷后的防御反應。50四、細胞因子對缺血性神經元的損傷作用細胞因子（cytokin大腦中動脈主干閉塞：表現(xiàn)為對側偏癱

28、、偏身感覺障礙和偏盲?？煞譃槿悾旱谝活愑蒻GluR1和mGluR5組成(激活PKC)；在出生以后腦內神經元的數(shù)目和類型就不再發(fā)生變化；同時損傷的DNA可以激活細胞內的自身修復機制。KA受體由3個亞單位構成，它們分別是GluR5、GluR6和GluR7。bcl-2具有很明顯的神經細胞保護作用。突觸間隙谷氨酸含量升高反映多種可能性，即釋放增加或再攝取障礙，或兩者兼有之。二、腦梗死的臨床表現(xiàn)梗死的邊緣區(qū)又稱為半影區(qū)（penumbra）。mGluR分布于突觸前和突觸后膜上，功能研究表明，mGluR激動劑本身沒有明顯的神經細胞毒的作用，但可通過激活PKC的活性，調節(jié)離子型谷氨酸受體激動劑的毒性作用。a

29、ctin被降解時DNAase I活性也增加，使DNA的雙鏈斷裂，造成細胞及細胞核的破壞。如果這類損傷得不到及時的修復，將在轉錄和復制過程中引起鏈延長終止或編碼屬性的改變，則將造成神經細胞的退行性變或突變。腦缺血后引起腦內谷氨酸生物轉換功能加強，細胞內Ca2超載，自由基大量生成，造成DNA損傷，最終導致缺血神經元的死亡。凋亡細胞具有其自身的病理特征，根據其特征可采用相應的研究手段加以觀察 ：谷氨酸是中樞神經系統(tǒng)中主要的興奮性神經遞質。IL-1可能通過caspase及iNOS-NO介導通路發(fā)揮其生物效應 。（一）白介素-1及其受體 IL-1分為IL-1與IL-1兩種。相似處：分子量、結構、生物活性

30、。不同處：它們分別來源于兩個不同的前體基因 。生物合成后的IL-1大部分仍保持膜結合特性；而IL -1則分泌發(fā)揮作用，IL-1通過與靶細胞表面的特異受體結合來發(fā)揮活性。IL-1原（pro-interleukin-1）本身是無活性的前體，通過白介素-1轉換酶（interleukin-1 converting enzyme, ICE）的水解形成有活性的IL-1。 51大腦中動脈主干閉塞：表現(xiàn)為對側偏癱、偏身感覺障礙和偏盲。（一IL-1受體可分為兩種，即I型與型。結構：均含胞內和胞外結構兩部分。兩種受體的胞外結構均含有三個免疫球蛋白樣結構域，而胞內結構具有很大的差異。 功能：IL-1 I型受體興奮時

31、，激活信號轉導通路發(fā)揮作用 ；IL-1 型受體對信號轉導通路無作用，但具有抑制IL-1的生物活性作用。 分布：這兩種受體的分布并不完全一樣，具有動物的分布差異，如IL-1受體主要分布在小鼠，而IL-1受體則主要在大鼠。52IL-1受體可分為兩種，即I型與型。54（二）白介素-1作用的信號轉導通路及其與神經損傷細胞因子與其受體結合可激活胞內信號轉導通路 ，包括誘導磷脂水解，細胞內腺苷酸環(huán)化酶升高，蛋白酪氨酸磷酸化；IL-1還可激活磷酸質酯酶，特異地通過神經鞘磷脂（sphingomyeline）產生神經酰胺（ceramide）；IL-1可能通過caspase及iNOS-NO介導通路發(fā)揮其生物效應

32、。53（二）白介素-1作用的信號轉導通路及其與神經損傷55圖4-5 白介素-l作用的信號轉導通路示意圖54圖4-5 白介素-l作用的信號轉導通路示意圖56 IL-1在神經細胞損傷和保護方面的調節(jié)作用 ：整體研究：缺血損傷時腦內IL-1的高表達可能不利于神經元的保護效應。 離體研究：離體神經細胞培養(yǎng)的研究則獲得完全相反的結果。 離體及整體實驗研究的矛盾結果提示，IL-1的直接和間接作用機制具有很大的差異，其原因更有待于深人研究。 55 IL-1在神經細胞損傷和保護方面的調節(jié)作用 ：57五、缺血性神經元的凋亡及其調節(jié)在形態(tài)、生化、細胞和分子生物學各方面的研究證明，缺血損傷的神經元死亡方式，不僅僅是

33、壞死，也存在凋亡。一般認為，腦缺血引起的急性期神經元死亡是以壞死（necrosis）為主，而繼發(fā)性死亡（secondary neuronal death）或遲發(fā)性死亡（delayed neuronal death）則以凋亡為主，前者發(fā)生在缺血后較早的中心區(qū)，后者多發(fā)生在缺血幾天以后的半暗區(qū)。56五、缺血性神經元的凋亡及其調節(jié)在形態(tài)、生化、細胞和分子生物學TTC染色示局部腦缺血57TTC染色示局部腦缺血59細胞凋亡（apoptosis）：是指為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等

34、的作用；它在生理及病理條件下均存在。細胞發(fā)生凋亡時，就像樹葉或花的自然凋落一樣，對于這種生物學觀察，借用希臘“Apoptosis”來表示，意思是像樹葉或花的自然凋落，可譯為細胞凋亡。58細胞凋亡（apoptosis）：是指為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因（一）缺血性神經元的凋亡現(xiàn)象 凋亡細胞具有其自身的病理特征，根據其特征可采用相應的研究手段加以觀察 ：用凝膠電泳的技術可觀察到典型的梯形條帶，以反映組織中DNA斷裂的情況； 用3-末端標記的原位雜交技術觀察TUNEL染色陽性細胞，以反映細胞內DNA的斷裂； 用不同的組織染色法結合電鏡或光鏡觀察技術，可以反映細胞核膜情況、核仁破裂及凋亡小體； 用特異性標

35、記的手段可觀察有關凋亡因子的變化。 許多實驗研究從形態(tài)、生化和功能分析不同角度都表明缺血后確實存在神經元的凋亡過程。 59（一）缺血性神經元的凋亡現(xiàn)象61凝膠電泳顯示凋亡細胞DNA片段lane A:對照組; lane 肢體缺血組; lane C:腦缺血組; lane D: LIP group60凝膠電泳顯示凋亡細胞DNA片段lane A:對照組; laTUNEL染色神經元細胞凋亡細胞(細箭頭)，壞死細胞(粗箭頭)40061TUNEL染色神經元細胞凋亡細胞(細箭頭)，壞死細胞(粗箭腦缺血海馬CA1區(qū)染色A: Caspase-3免疫染色200B: Caspase-3 mRNA原位雜交200 62腦

36、缺血海馬CA1區(qū)染色A: Caspase-3免疫染色2CA1區(qū)bax陽性神經元200CA3區(qū)bcl-2陽性神經元20063CA1區(qū)bax陽性神經元200CA3區(qū)bcl-2陽性神經元（二）參與缺血性神經元凋亡的因子細胞的凋亡被認為是一個主動過程，是通過合成某些新的蛋白質而實現(xiàn)的。目前認為，參與這些調轉的內部因子很多。在中樞神經系統(tǒng)，參與缺血性神經細胞凋亡基因研究最多的可概括成兩大類：即bcl-2家族和Caspases家族。其他還包括p53，NF-B等。 64（二）參與缺血性神經元凋亡的因子66 1.Caspases族調亡基因Caspases作為半胱氨酸(cysteine)蛋白水解酶，使無活性的P

37、ro-IL-1（Pro-interleukin-1）水解成有活性的IL-1，因此曾具有ICE（即白介素-1轉換酶, interleukin-1 converting enzyme）之稱。Caspases還可特意地水解Asp-X肽鏈，形成大小不等的有生物活性的片段，從而行使或執(zhí)行凋亡指令。Caspeses本身有以酶原的形式存在于體內，又可作為這類酶的底物被水解成有生物活性的蛋白分子。根據其生物特性命名為cysteine aspartate-specific proteinases簡稱Caspases。目前認為Caspases主要有Caspasesl-10共10種。 65 1.Caspases族調

38、亡基因67表4-1 Caspases的命名及其底物和酶抑制劑66表4-1 Caspases的命名及其底物和酶抑制劑68采用基因敲除或基因突變的技術研究表明，Caspases在凋亡過程中各自行使其不同的作用。其中Ced-3及Ced-4是最早被發(fā)現(xiàn)并證明具有促進細胞凋亡作用的基因，而Ced-9則是最早被發(fā)現(xiàn)的具有抑制凋亡作用的基因。 根據表4-1可以看出，很多酶的底物本身參與DNA的修復或RNA的合成作用。不難理解當這些底物在酶的催化下裂解而喪失原有的修復功能，進一步加劇細胞的損傷。又由于這些底物多分布于細胞核上，當自身降解后往往導致細胞形態(tài)學上的變化，包括染色體濃縮及DNA斷裂的片段形成。 67

39、采用基因敲除或基因突變的技術研究表明，Caspases在凋亡圖4-6 Caspases基因線蟲細胞凋亡的調節(jié)作用示意圖采用基因突變技術研究提出細胞凋亡過程可分成四個階段，即死亡決定期(decision to die)；死亡執(zhí)行期(execution to death)；死亡細胞清理期(engulfment)及死亡細胞消化期(degradation)。Caspases及有關基因作用在第一期，僅引起少數(shù)細胞凋亡，而作用在以后的三期內則導致所有細胞的凋亡。 68圖4-6 Caspases基因線蟲細胞凋亡的調節(jié)作用示意圖7具有修復作用的底物主要有： （1）PARP是DNA修復酶：參加由p53誘導的DN

40、A鏈斷裂的修復。PARP被Caspases-1，4，6，7分別酶解后，其DNA的修復作用也被阻止。 （2）DNA-PK（DNA-dependent protein kinase）：主要DNA采納于雙鏈斷裂的修復。當Caspases-3酶活性增加使DNA-PK的活性消失，導致細胞損傷后DNA的修復能力的抑制。 69具有修復作用的底物主要有： 71 （3）actin：是重要的細胞骨架蛋白。actin被降解時DNAase I活性也增加，使DNA的雙鏈斷裂，造成細胞及細胞核的破壞。 （4）lamins：是細胞核骨架蛋白，抑制lamins降解對染色體濃縮無作用，但是可以預防細胞核的皺縮及DNA的斷裂。

41、（5）hn RNP(heteronuclear ribonucleoproteins)：參與RNA的延長和蛋白質的轉錄過程，從而抑制凋亡的啟動。但是，當Caspases降解hn RNP后，hn RNP的這一作用遭到破壞。70 （3）actin：是重要的細胞骨架蛋白。actin被降解時2.腦缺血后神經細胞內Caspases活性變化與神經元存亡的相關分析 Caspases-1酶原(proenzyme) 水解(Caspase-l、3參與) 有活性的Caspase-1(白介素-1轉化酶, ICE) 水解Pro-IL-1 有生物活性的小分子IL-1，參與炎癥及細胞凋亡導致缺血后神經細胞的死亡。腦缺血后，

42、腦內的IL-1增加；腦內ICE及IL-1 mRNA和Caspases-1及Caspases-3的表達均增加；Caspases-1mRNA及Caspases-3mRNA的表達增加。712.腦缺血后神經細胞內Caspases活性變化與神經元存亡的Caspases參與凋亡調節(jié)： 用Caspases酶活性抑制劑z-VAD可明顯地抑制腦缺血所引起的ICE和IL-1變化，以及DNA的降解作用； 用轉基因動物觀察到抑制神經元內Caspases-1表達或ICE基因突變后，不僅縮小腦缺血引起的腦梗塞灶，而且減輕神經功能障礙；采用非選擇性Caspase抑制劑及相對選擇性Caspase-1及Caspase-3抑制劑

43、，研究結果兩者均有明顯的腦保護作用，包括縮小缺血性腦梗塞體積和減輕神經功能的退化。Caspase基因參與了缺血后的神經元凋亡過程，IL-1不僅參與炎癥性神經元的死亡，而且也參與凋亡過程。 72Caspases參與凋亡調節(jié)： 743.Bcl-2基因族調亡抑制因子及其促進因子Bcl-2是由一族蛋白質構成，其結構上均含兩個以上結合區(qū)，即BH1，BH2或BH3，功能上又將bcl-2族蛋白分成凋亡誘導因子（apoptosis inducers）包括bax，bcl-x5，bad，bak，bik，以及凋亡抑制因子（apoptosis inhibitors）如bcl-2，bcl-xl，mcl-1。 Bcl-2

44、對正常細胞的功能和代謝幾乎無明顯影響，但對病理性細胞的凋亡具有一定的抑制作用。 733.Bcl-2基因族調亡抑制因子及其促進因子75這族蛋白的功能通常以二聚體蛋白存在的形式而決定。當bcl-2與bcl-2的二聚體形式存在時，則發(fā)揮抑制細胞凋亡的生理功能，而當bcl-2與bax，或bcl-2與bad形成二聚體后，則bcl-2的抑制凋亡作用被取消，從而促進凋亡發(fā)生。 BH1和BH2與bcl-2二聚體蛋白形成有關，而BH3則對bax，bak及bip二聚體形成有重要意義，因此被認為具有促進凋亡作用的結合區(qū)。 bcl-2蛋白的磷酸化可以影響其功能和細胞內分布。 74這族蛋白的功能通常以二聚體蛋白存在的形

45、式而決定。當bcl-2bcl-2抑制細胞凋亡的機制：抑制細胞膜上脂質過氧化物的形成，從而阻止氧化應激導致的細胞凋亡。 對線粒體膜通透性的調節(jié)。在凋亡過程中bcl-2可穩(wěn)定線粒體功能，提高細胞對缺血損傷的耐受能力。抑制線粒體釋放細胞色素c。抑制Ced-4致細胞凋亡作用。在研究Caspases的凋亡機制中，最最常用的實驗模型是C.elegans線蟲。75bcl-2抑制細胞凋亡的機制：774.Bcl-2對缺血性神經元的保護作用 bcl-2具有很明顯的神經細胞保護作用。雖然，bcl-2在腦缺血中的作用研究得還是很初步的，但是其結果已經顯示bc1-2在阻止損傷性神經元死亡中起相當重要的作用。 在全腦缺血

46、實驗動物模型上觀察到，缺血后導致海馬CA1區(qū)的神經元死亡，而海馬CA3區(qū)和齒狀回的神經元仍然存活。bcl-2僅表達在海馬CA3區(qū)和齒狀回的存活的神經元上，而bax凋亡基因則表達在海馬CA1區(qū)注定要死亡的神經元上； 用NMDA受體拮抗劑可以明顯地增加缺血的邊緣區(qū)bc1-2蛋白表達，同時增加該區(qū)域存活的神經元；764.Bcl-2對缺血性神經元的保護作用 78采用抗自由基的處理，使缺血再灌注區(qū)羥自由基生成量減少，bcl-2表達陽性的細胞明顯增加，同時產生顯著的細胞保護作用；轉基因動物實驗研究證明，bcl-2的過量表達可以預防缺血引起的神經元的凋亡；在培養(yǎng)的神經元上所進行的研究表明，使bcl-2高表達

47、的神經元具有抵抗谷氨酸神經毒、高鈣或自由基堆積致細胞死亡的作用。從整體和離體不同水平、不同角度說明bcl-2在缺血性神經元損傷中具有一定的細胞保護作用，但是 bcl-2在腦缺血中的神經保護作用機制有待進一步闡明。77采用抗自由基的處理，使缺血再灌注區(qū)羥自由基生成量減少，bc（三）缺血神經元凋亡的線粒體機制 線粒體在缺血性神經元凋亡過程中起十分關鍵的作用，許多參與凋亡調節(jié)的因子分布在線粒體，或由線粒體調節(jié)釋放。 缺血損傷時，自由基堆積，產生DNA的氧化損傷。誘導和激活了細胞內參與凋亡的途徑中的各種因子（bcl-2二聚體解聚，激活了bax或bid），線粒體膜電位超常去極化，釋放線粒體釋放蛋白（如細

48、胞色素C、凋亡誘導因子AIF和smac/DIALO蛋白），以不同的作用方式發(fā)揮其促凋亡的作用。 78（三）缺血神經元凋亡的線粒體機制 80當Cyt C釋放后，以2:1的形式與Apaf蛋白形成復合體，后者使無活性的caspase-9水解形成有活性的caspase-9，繼而形成Cyt C-Apaf-caspase-9復合體，從而激活caspase-3；當活化的smac/DIALO蛋白從線粒體釋放后，其N-末端與凋亡抑制蛋白（apoptosis inhibiting protein, AIP）結合，從而取消AIP對caspase-9和caspase -3的抑制效應，導致細胞凋亡；AIF是一種線粒體釋

49、放的caspases非依賴的凋亡誘導相關蛋白 。79當Cyt C釋放后，以2:1的形式與Apaf蛋白形成復合體，圖4-7 缺血損傷神經細胞凋亡調節(jié)通路示意圖80圖4-7 缺血損傷神經細胞凋亡調節(jié)通路示意圖82第三節(jié) 神經細胞的內源性保護 腦缺血后引起腦內谷氨酸生物轉換功能加強，細胞內Ca2超載，自由基大量生成，造成DNA損傷，最終導致缺血神經元的死亡。當機體受到各種有害侵襲時，往往會有一些內源性保護反應，以實現(xiàn)機體的自身保護。目前已經了解到腦內存在一些自身保護機制。概括地講，這些機制主要包括內源性保護因子和內源性修復兩大方面。 81第三節(jié) 神經細胞的內源性保護 腦缺血后引起腦內谷氨酸生物轉一、

50、內源性保護因子 當大腦受到各種損傷時，腦內除激活誘導細胞死亡的因子分泌外，同時激活腦內的保護因子。這些內源性神經保護因子包括神經營養(yǎng)因子，抗氧化防御系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽過氧化物（glutathione peroxidase）、金屬離子轉運結合蛋白、抑制性神經遞質GABA、腺苷、細胞因子中的內源性IL-1拮抗劑、IL-10、熱休克蛋白、雌激素、谷氨酸受體GluR2亞型、谷氨酸載體以及凋亡抑制因子等。當它們的功能加強時，具有明顯的神經細胞保護效應。 82一、內源性保護因子 84二、內源性修復機制（一）缺血損傷神經細胞內DNA的修復D

51、NA修復機制及其通路十分復雜。DNA的修復通路大致分為以下幾種：一步反應修復和多步反應修復。 多步反應修復包括堿基切除修復、核苷酸切除修復和雙鏈DNA損傷修復。這類DNA的修復往往需要許多蛋白和酶的參與（包括參與DNA雙鏈斷裂識別的蛋白、參與剪切修復的復合蛋白和雙螺旋蛋白等 ），并形成有功能的復合體共同配合修復。 DNA損傷后，其損傷區(qū)首先被識別，而后被剪切剔除，再行缺口修補、連接等步驟。 83二、內源性修復機制85缺血損傷時腦內DNA修復功能加強，表現(xiàn)在早期DNA的摻入增加、多種DNA的修復因子表達功能加強（包括剪切修復和轉錄修復因子）。 動物個體間的DNA修復能力有很大的差異，但是細胞核和線粒體內都存在DNA氧化損傷及其修復，而且其修復速率是基本相同的。 神經細胞內的DNA究竟是如何修復的還有待進一步解決。 84缺血損傷時腦內DNA修復功能加強，表現(xiàn)在早期DNA的摻入增加（二）神經元的再生修復 長期以來人們一直認為成年哺乳動物的腦在生理情況下是一個極其穩(wěn)定的器官。在出生以后腦內神經元的數(shù)目和類型就不再發(fā)生變化；受到損傷后，腦內神經元的數(shù)目只會減少進而導致腦的功能受損。 然而近半個世紀來的研究表明，成年哺乳動物的腦同