混合物紅外光譜分析的關(guān)鍵方法和技術(shù)

1、孫素琴清華大學(xué)化學(xué)系復(fù)雜混合物紅外光譜分析的關(guān)鍵方法和技術(shù)中藥等復(fù)雜混合物質(zhì)量控制的難題成分2成分1 成分復(fù)雜多樣，難以完全逐一分離并檢測(cè)指標(biāo)成分不夠全面不能準(zhǔn)確反映中藥藥效和質(zhì)量難以鑒別藥材產(chǎn)地等多種屬性無(wú)法安全控制其他大多數(shù)成分檢測(cè)困難檢測(cè)方法復(fù)雜且檢測(cè)成本過(guò)高缺乏定性分析而導(dǎo)致定量錯(cuò)誤人為添加可改變指標(biāo)成分含量“先分離，后分析”的混合物分析路線一般分析過(guò)程中首先要從混合物中分離出相應(yīng)的純組分，然而分離并不等同于分析。分離只是將混合物分解為不同部分，而各部分的結(jié)構(gòu)和含量確定還需要多種分析方法相結(jié)合。對(duì)混合物進(jìn)行分離，不可避免對(duì)原成分造成影響，分離所得物質(zhì)與原始成分往往具有一定的差異。對(duì)混合

2、物進(jìn)行分離，很難直接觀察到各種成分共存時(shí)的相互作用。對(duì)混合物進(jìn)行分離并對(duì)所有組分逐一分析，需要消耗大量的時(shí)間、人力和物力?！跋确蛛x，后分析”的混合物分析路線實(shí)際過(guò)程中研究者們往往只關(guān)注所感興趣的一小部分分離產(chǎn)物，不能夠得到混合物整體成分信息。如果提取分離方法不恰當(dāng)，就無(wú)法得到待測(cè)樣本中所含有的全部的目標(biāo)成分，而且會(huì)在分離產(chǎn)物中混入其他雜質(zhì)成分。如果對(duì)于分離產(chǎn)物沒(méi)有進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析，就可能將雜質(zhì)成分與目標(biāo)成分混淆在一起，影響定量分析的準(zhǔn)確性。中藥成分信息的多維層次結(jié)構(gòu)與合理分析原則全部成分部分成分單一成分主體成分少量成分微量成分定性信息定量信息宏觀整體樣本微觀局部樣本漸進(jìn)式分析：從整體到部分，

3、先定性后定量有些信息只要粗略了解，有些信息必需細(xì)致分析中藥等復(fù)雜混合物質(zhì)量控制的合理路線中藥整體定量部分定性全部成分，指紋圖譜特定成分，定性定量混合物分析：從整體到部分，層層深入整體：完整樣本，所有成分部分：局部樣本，特定成分兔子血管壁（可見(jiàn)圖像）紅外圖像(化學(xué)圖像)血管壁膽固醇結(jié)塊局部樣本紅外光譜(化學(xué)成分)蛋白質(zhì)脂肪混合物分析：先定性后定量，準(zhǔn)確無(wú)誤蛋白質(zhì)N轉(zhuǎn)化為NH4+NH3三聚氰胺蛋白質(zhì)含量分析三聚氰胺未知物定性: 是不是？定量: 有多少？為什么選擇紅外光譜？紅外光譜是一種無(wú)需標(biāo)記的分析技術(shù)，在沒(méi)有先驗(yàn)知識(shí)的情況下即可使用；既可以同時(shí)獲取混合物中整體成分信息，又可以對(duì)特定成分進(jìn)行有針對(duì)

4、性的檢測(cè)。隨著計(jì)算機(jī)與化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)的發(fā)展，紅外光譜不僅可以對(duì)混合物成分進(jìn)行詳細(xì)的定性分析，還可以對(duì)特定成分進(jìn)行相當(dāng)準(zhǔn)確的定量分析。紅外光譜既可以對(duì)較大尺寸的混合物樣品進(jìn)行分析，也可以借助顯微鏡對(duì)納克級(jí)的微小樣品進(jìn)行檢測(cè)，還可以研究宏觀樣本中微米級(jí)的局部區(qū)域。豐富靈活的采樣技術(shù)使各種形態(tài)樣品的紅外光譜測(cè)試都可以做到簡(jiǎn)便、快速、無(wú)損，儀器通用，成本低廉，環(huán)境友好。紅外光譜適合與其它分析技術(shù)聯(lián)用，獲得全面的樣品信息?！安环蛛x，即分析”的混合物分析路線簡(jiǎn)化步驟而節(jié)約時(shí)間和成本得到樣本全部成分整體信息獲取各種成分相互作用信息避免指標(biāo)成分分析種種弊端“邊分離，邊分析”的混合物分析路線要對(duì)混合物進(jìn)行全面準(zhǔn)

5、確的分析研究，應(yīng)該遵循“從整體到部分，先定性后定量”的路線原則，在紅外光譜的指導(dǎo)下，對(duì)混合物進(jìn)行逐步分離與分析。紅外光譜可以提供混合物整體成分信息，指導(dǎo)進(jìn)一步的分離分析；紅外光譜可以監(jiān)督各步分離產(chǎn)物的成分，檢查分離方法的合理性，揀選含有目標(biāo)成分的分離產(chǎn)物；紅外光譜可以用于解析和確認(rèn)各種分離組分的結(jié)構(gòu)“邊組合，邊分析”的混合物分析路線對(duì)混合物進(jìn)行分析研究，了解其構(gòu)成與性質(zhì)的聯(lián)系，能夠?yàn)榈玫骄哂懈鼉?yōu)異性質(zhì)的混合物提供指導(dǎo)。在混合物組合過(guò)程中，紅外光譜可檢查原料的正確性及其純度，避免錯(cuò)誤原料和過(guò)量雜質(zhì)的引入；可監(jiān)控組合過(guò)程，及時(shí)發(fā)現(xiàn)組合過(guò)程中出現(xiàn)的異常，為過(guò)程工藝的優(yōu)化提供信息；可對(duì)中間產(chǎn)物進(jìn)行快速

6、分析，避免不合格產(chǎn)物進(jìn)入下一環(huán)節(jié)而導(dǎo)致不必要的損失；可對(duì)最終產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析，檢查其是否合乎相應(yīng)的要求。混合物的紅外光譜純化合物多組分混合物混合物光譜成分A光譜成分B光譜成分C光譜定量分析混合物紅外光譜可以提供的信息定性分析整體樣本/局部區(qū)域整體成分特定成分混合物紅外光譜解析的三大難題根源：成分復(fù)雜，譜圖重疊樣本分辨難如何獲得優(yōu)質(zhì)譜圖如何提高分辨能力如何增加信息表達(dá)成分解析難如何解析主體成分如何解析特定成分如何解析相對(duì)含量譜圖分析難如何智能化解析如何智能化鑒別如何智能化定量混合物紅外光譜宏觀指紋特征Wavenumber/cm-1Absorbance同種官能團(tuán)吸收峰相鄰，重疊峰給出物質(zhì)群組信

7、息鄰、間、對(duì)二甲苯混合物混合物紅外光譜宏觀指紋特征鄰二甲苯間二甲苯對(duì)二甲苯等體積混合物光譜加和Wavenumber/cm-1Absorbance混合物光譜包含各組分特征峰混合物紅外光譜宏觀指紋特征Wavenumber/cm-1Absorbance特征峰表現(xiàn)與濃度和重疊程度有關(guān)間二甲苯90% 間二甲苯50% 間二甲苯33% 間二甲苯5% 間二甲苯混合物紅外光譜宏觀指紋特征p-m-m-o-Wavenumber/cm-1Absorbance鄰、間、對(duì)二甲苯 1 ：1 ：1 2 ：1 ：1 1 ：1 ：2 1 ：2 ：1成分種類(lèi)或含量不同，混合物光譜不同混合物紅外光譜解析方法多級(jí)紅外光譜宏觀指紋分析法

8、multilevel infrared spectral macro-fingerprints analysis使用多級(jí)光譜增強(qiáng)譜圖分辨能力根據(jù)特征譜峰進(jìn)行相應(yīng)組分解析借助統(tǒng)計(jì)方法實(shí)現(xiàn)客觀量化分析混合物紅外光譜解析的三大方法多級(jí)紅外光譜宏觀指紋分析法三級(jí)鑒別法傳統(tǒng)紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)光譜二維相關(guān)光譜整體解析法主體成分解析特定成分解析相對(duì)含量比較專(zhuān)家識(shí)別法光譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相似度量化比較多組分定量分析紅外光譜三級(jí)鑒別法一級(jí)鑒別（the primary identification）普通紅外光譜Conventional Infrared Spectroscopy, conventional IR二級(jí)鑒別（

9、the secondary identification）二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜Second Derivative Infrared Spectroscopy, SD-IR三級(jí)鑒別（the tertiary identification）二維相關(guān)紅外光譜Two-dimensional Correlation Infrared Spectroscopy, 2D-IRInfrared Spectral Tri-step Identification普通紅外光譜精密度，準(zhǔn)確度，信噪比，分辨率Wavenumbers / cm-1AbsorbanceCO2和H2O干擾扣除1.00000.99970.99981

10、.00000.9998相關(guān)系數(shù)平均光譜標(biāo)準(zhǔn)差光譜重復(fù)性二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜：葡萄糖/乙醇-水溶液FTIR12%乙醇20 g/L葡萄糖12%乙醇60 g/L葡萄糖12%乙醇100 g/L葡萄糖12%乙醇Wavenumbers / cm-1SDIRWavenumbers / cm-1二維相關(guān)紅外光譜OriginalDynamic2DCOS二維相關(guān)紅外光譜：葡萄糖/乙醇-水溶液108510441152110710851065104410249921152110710851044102499211071085104499212%vol乙醇-水20 g/L葡萄糖12%vol乙醇-水60 g/

11、L葡萄糖12%vol乙醇-水100 g/L葡萄糖12%vol乙醇-水真?zhèn)伟⒛z：第一級(jí)鑒別Wavenumbers / cm-1Absorbance東阿阿膠假阿膠真?zhèn)伟⒛z：第二級(jí)鑒別Wavenumbers / cm-12nd derivative 東阿阿膠假阿膠真?zhèn)伟⒛z：第三級(jí)鑒別假阿膠東阿阿膠v混合物紅外光譜解析的三大方法多級(jí)紅外光譜宏觀指紋分析法三級(jí)鑒別法傳統(tǒng)紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)光譜二維相關(guān)光譜整體解析法主體成分解析特定成分解析相對(duì)含量比較專(zhuān)家識(shí)別法光譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相似度量化比較多組分定量分析主體成分解析官能團(tuán)分析脂肪蛋白質(zhì)糖類(lèi) 全脂奶粉（104）奶粉的紅外光譜中藥主體成分解析：蛋白質(zhì)羚羊角麝香水蛭

12、相思子Wavenumbers / cm-1Absorbance中藥主體成分解析：蛋白質(zhì)1639Wavenumbers / cm-12nd derivative羚羊角麝香水蛭相思子中藥主體成分解析：油脂火麻仁芥子萊菔子烏梅 Wavenumbers / cm-1Absorbance中藥主體成分解析：油脂火麻仁芥子萊菔子烏梅 285417472nd derivative / Wavenumbers / cm-1/特定成分解析標(biāo)準(zhǔn)品比較ABC乳糖Wavenumbers / cm-1Absorbance特定成分解析標(biāo)準(zhǔn)品比較乳糖樣品A樣品B樣品C峰位置/cm-1(閾值0.01A)352933823345

13、352433803343338029782934290129002901147014561436145614391457144014571440138313671359138113671359138213801341129612611341129612611342126013431260120211681142120211671143120111661143120211631143111610941083111610941083111610931116107110581034107110581035107110581036107010371019100498710199881020989989

14、915899875915898876915898876914898875778671631779631779631779632604566551605566551604552604551467445434468434469469對(duì)應(yīng)峰個(gè)數(shù)39332520相同峰個(gè)數(shù)391875相關(guān)系數(shù)1.00000.91240.80980.6436特定成分解析標(biāo)準(zhǔn)品比較Wavenumber / cm-1Absorbance白鮮皮地骨皮桑葉銀杏葉草酸鈣中藥指標(biāo)成分解析：黃連Wavenumbers / cm-1Absorbance黃連藥材鹽酸小檗堿中藥指標(biāo)成分解析：黃連Wavenumbers / cm-12nd d

15、erivative黃連藥材鹽酸小檗堿中藥指標(biāo)成分解析：淫羊藿Wavenumbers / cm-1Absorbancea.脫水淫羊藿素b.寶藿苷Ic.箭葉苷Bd.淫羊藿苷e.淫羊藿定Bf.淫羊藿定Cg.淫羊藿屬苷Ah.意卡瑞甙Ci.山奈酚j.槲皮素R=HR=CH3中藥指標(biāo)成分解析：淫羊藿IRHPLCIRHPLC相對(duì)含量比較相對(duì)峰強(qiáng)度脂肪蛋白質(zhì)糖類(lèi)全脂奶粉低脂奶粉脫脂奶粉Wavenumbers / cm-1Absorbance相對(duì)含量比較相對(duì)峰強(qiáng)度鹿茸鹿角鹿角霜磷酸鈣Wavenumber / cm-1Absorbance混合物紅外光譜解析的三大方法多級(jí)紅外光譜宏觀指紋分析法三級(jí)鑒別法傳統(tǒng)紅外光譜二

16、階導(dǎo)數(shù)光譜二維相關(guān)光譜整體解析法主體成分解析特定成分解析相對(duì)含量比較專(zhuān)家識(shí)別法光譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相似度量化比較多組分定量分析數(shù)據(jù)庫(kù)檢索純化合物數(shù)據(jù)庫(kù)五倍子藥材樣本在Sadtler譜庫(kù)中檢索結(jié)果數(shù)據(jù)庫(kù)檢索混合物數(shù)據(jù)庫(kù)unknown samplethe 1st hit模式識(shí)別-基本概念模式識(shí)別（Pattern Recognition）就是分類(lèi)?？陀^存在可以觀察的事物，如果可根據(jù)一定規(guī)則進(jìn)行相似性判別，都可稱之為模式。模式識(shí)別就是通過(guò)特定方法將樣本分成有實(shí)際意義的類(lèi)別。模式識(shí)別是人工智能技術(shù)的分支，它試圖用計(jì)算機(jī)代替人工對(duì)各種模式進(jìn)行描述、分類(lèi)和決策，從中找出規(guī)律，達(dá)到識(shí)別事物的目的。原始數(shù)據(jù)（訓(xùn)練集）

17、特征提取訓(xùn)練與分類(lèi)分類(lèi)規(guī)則未知樣本分類(lèi)結(jié)果方法的選擇光譜比對(duì)某一樣品與一系列參考光譜比較簡(jiǎn)單，易操作單個(gè)樣品即可需要選擇各種“數(shù)學(xué)過(guò)濾器”降低制樣帶來(lái)的影響模式識(shí)別一組樣品進(jìn)行比較方法靈敏至少需要5個(gè)樣品需要借助數(shù)學(xué)方法進(jìn)行識(shí)別數(shù)據(jù)預(yù)處理原始量測(cè)數(shù)據(jù)同一樣本的不同性質(zhì)不同樣本的同一性質(zhì)X為m個(gè)樣本在n個(gè)變量處的測(cè)量值，比如測(cè)量m個(gè)樣本在n個(gè)波數(shù)處的吸光度值而得到的紅外光譜，也可以是m個(gè)樣本中n種成分的含量。數(shù)據(jù)預(yù)處理不同樣本的同一性質(zhì)中心化自動(dòng)調(diào)整值域調(diào)整數(shù)值歸一化模長(zhǎng)歸一化權(quán)重調(diào)整相似性方向余弦相似性系數(shù)相關(guān)系數(shù)相似性越大樣本間越相像相似度量化相關(guān)系數(shù)相關(guān)系數(shù)產(chǎn)地相關(guān)系數(shù)產(chǎn)地相關(guān)系數(shù)產(chǎn)地1.

18、0000河南武陟0.9822河南武陟0.9738廣東0.9922河南武陟0.9821河南溫縣0.9733云南0.9898河南博愛(ài)0.9817河南溫縣0.9623山西太谷0.9890河南修武0.9815河南武陟0.9606河北安國(guó)0.9885河南溫縣0.9814河南武陟0.9605山西襄汾0.9877河南武陟0.9813河南沁陽(yáng)0.9600山西汾陽(yáng)0.9872河南沁陽(yáng)0.9809河南武陟0.9578山西平遙0.9868河南孟縣0.9794山東單縣0.9544山西平遙0.9865河南武陟0.9793河北安國(guó)0.9516山西太谷0.9854河南溫縣0.9781山西平遙0.9422山東濟(jì)寧0.9842

19、河南溫縣0.9776陜西西安0.9402廣西0.9837河南溫縣0.9772廣東0.9214山西汾陽(yáng)0.9830河南溫縣0.9765山西曲沃0.9101浙江東陽(yáng)0.9825河南溫縣0.9762河北安國(guó)0.8881河北安國(guó)0.9824河南孟縣0.9754山西平遙0.8486山西平遙懷山藥不同產(chǎn)地山藥與對(duì)照品的相關(guān)系數(shù)（1590-1390cm-1）是不是相關(guān)系數(shù)比較相似度量化模式識(shí)別山藥基本原理單組份定量（單波長(zhǎng)定量） 多組份定量（譜圖重疊，全譜定量）A = K C工作曲線法實(shí)例根據(jù)中藥配方顆粒的紅外光譜確定其中輔料含量不同糊精含量的丹參配方顆粒的紅外光譜圖a.0.0, b.9.97, c.20.

20、55, d.29.81, e.39.82, f.49.80, g.59.62, h.100%工作曲線法實(shí)例相對(duì)峰強(qiáng)度的計(jì)算峰強(qiáng)度的計(jì)算工作曲線法實(shí)例丹參配方顆粒糊精工作曲線法實(shí)例根據(jù)奶粉的紅外光譜確定其中乳糖含量決定系數(shù)奶粉奶粉+乳糖乳糖組分定量分析工作曲線糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)糊精峰高1021cm-1, A1藥材峰高1611cm-1, A2相對(duì)峰強(qiáng)度A1/A2相對(duì)峰強(qiáng)度對(duì)數(shù)lg(A1/A2)0.0%0.81010.93650.8650-0.063012.0%0.86580.77581.11600.047722.2%0.90690.64641.40310.147129.3%0.97240.63881.5

21、2220.182544.0%0.96830.47022.05930.313749.7%0.96960.43122.24870.351958.6%0.98190.36922.65940.4248基線起止2000-880cm-1相關(guān)系數(shù)R0.99110.9986白扁豆藥材糊精 多元線性回歸K矩陣與P矩陣主成分回歸偏最小二乘回歸多組分定量分析選擇標(biāo)準(zhǔn)樣品集：定標(biāo)集、驗(yàn)證集其他方法獲得參照值：HPLC、GC確定化學(xué)計(jì)量學(xué)的算法PCA 主成分分析（定性）PCR+ - 增強(qiáng)的主成分回歸PLS1 偏最小二乘法（單組分）PLS2 偏最小二乘法（多組分）選擇合適的光譜參數(shù)：范圍、預(yù)處理模型評(píng)價(jià)：R2、SEE、S

22、EPPage 64 模型評(píng)價(jià)定標(biāo)集的決定系數(shù)R2判斷一個(gè)定標(biāo)集模型的好壞定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)差SEE 反映定標(biāo)集數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)偏差預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)差SEP給出一個(gè)獨(dú)立樣本在標(biāo)準(zhǔn)集中預(yù)測(cè)時(shí)所產(chǎn)生的誤差RSS = 殘差的平方和SYY = 總的方差組分定量分析多元校正1700-900cm-1SNV+De-trending二階導(dǎo)數(shù)R2=0.992SEE=0.001806SEP=0.00011311600-900cm-1SNV+De-trending二階導(dǎo)數(shù)R2=0.997SEE=0.000572SEP=0.0000879黃芩苷綠原酸雙黃連粉針劑指標(biāo)成分定量分析分離提取過(guò)程丹參丹參藥材95%醇提殘?jiān)?5%醇提物95%醇提丹參酮

23、IIA分離提取過(guò)程丹參95%醇提物濾液沉淀（總酮）加水溶解分離提取過(guò)程丹參加水提取95%醇提殘?jiān)嵛锼釟堅(jiān)蛛x提取過(guò)程丹參加醇至70%95%醇提殘?jiān)嵛餅V液沉淀（多糖）水蘇糖丹酚酸B分離提取過(guò)程丹參乙酸乙酯萃取95%醇提殘?jiān)嵛锎汲翞V液水層酯層（總酸）丹參酮IIA水蘇糖丹酚酸B分離提取過(guò)程丹參分離提取過(guò)程甘草藥材水提10%醇提20%醇提90%醇提100%醇提甘草苷黃酮類(lèi)成分增加糖類(lèi)酸類(lèi)成分減少分離提取過(guò)程甘草甘草藥材95%醇提物95%醇提殘?jiān)蛛x提取過(guò)程甘草甘草藥材95%醇提物總黃酮甘草苷乙酸乙酯萃取分離提取過(guò)程甘草甘草藥材95%醇提殘?jiān)?0%醇提物10%醇提殘?jiān)蛛x提取過(guò)程甘草10%醇提物60%醇沉沉淀60%醇沉濾液含糖醛酸（酯）的多糖分離提取過(guò)程甘草總皂苷10%醇提物60%醇沉濾液甘草酸銨加酸沉淀分離提取過(guò)程甘草甘草藥材殘?jiān)碥拯S酮多糖紅外光譜法用于中藥等混合物分析的三大特性快速、簡(jiǎn)便、直接、無(wú)損、全面一次性儀器購(gòu)置一次性樣品測(cè)試一次性譜圖分析一次性真實(shí)性無(wú)預(yù)處理存原本性反映全部成分信息跟蹤組分變化規(guī)律可控性同樣本重復(fù)性儀器間重現(xiàn)性操作者一致性紅外光譜相對(duì)于色譜的優(yōu)勢(shì)儀器重現(xiàn)性同一個(gè)樣本在所有儀器上得到的紅外譜圖都是一致的，不受測(cè)試時(shí)間、地點(diǎn)以及操作人員等因素影響；對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)