肝糖原的提取、鑒定與定量試驗(yàn)報(bào)告

1、南方雇科大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓 名:學(xué) 號(hào):專業(yè)年級(jí):組另I:生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí)驗(yàn)名稱肝糖原的提取、鑒定與定量實(shí)驗(yàn)日期實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)合作者指導(dǎo)老師評(píng)分XX教師簽名 李某某批改日期 2013-06-03格式要求：正文請(qǐng)統(tǒng)一用：小四號(hào)，宋體，1.5倍行距；數(shù)字、英文用Times New Roman ；標(biāo)題用：四號(hào)，黑體，加粗。需強(qiáng)調(diào)的地方請(qǐng)用藍(lán)顏色標(biāo)出。不得出 現(xiàn)多行、多頁(yè)空白現(xiàn)象。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握組織樣品的制備方法，了解其注意事項(xiàng)。2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鑒定與慈酮比色測(cè)定糖原含量的原理和注意事項(xiàng)， 掌握其操作方法。3、正確操作使用刻度吸管和可調(diào)微量取液器。4、熟練運(yùn)用溶液

2、混勻的各種方法。5、正確掌握溶液轉(zhuǎn)移的操作。6、正確操作使用分光光度計(jì)。二、實(shí)驗(yàn)原理1、肝糖原的提取與鑒定糖原儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)，采用研磨勻漿等方法可使細(xì)胞破碎，低濃度的三氯醋酸能使蛋 白質(zhì)變性，破壞肝組織中的酶且沉淀蛋白質(zhì)，而糖原仍穩(wěn)定地保存于上清液中，從而使 用糖原與蛋白質(zhì)等其它成分分離開(kāi)來(lái)。糖原不溶于乙醇而溶于熱水，故先用95%乙醇將 濾液中糖原沉淀，再溶于熱水中。糖原水溶液呈乳樣光澤，遇碘呈紅棕色。這是糖原中葡萄糖長(zhǎng)鏈形成的螺旋中， 依靠分子間引力吸附碘分子后呈現(xiàn)的顏色。糖原還可被酸水解為葡萄糖，利用呈色反應(yīng) 和葡萄糖的還原性，可判定肝組織中糖原的存在。CuSO4 十 2NaOH = Na2

3、SO4+Cu(OH)2 ；2Cu(OH)2 十 C6H12O6 = 2CuOH 十氧化型葡萄糖 +H2O2CuOH = Cu20；紅色)+H2OCu(OH)2= CuO；(黑色)+H2O2、肝糖原定量測(cè)定糖原在濃酸中可水解成為葡萄糖，濃硫酸能使葡萄糖進(jìn)一步脫水生成糠醛衍生物一5-羥甲基味喃甲醛，此化合物再與慈酮脫水縮合生成藍(lán)色的化合物。該物質(zhì)在620nm處有最大吸收。糖含量在(10100)g范圍內(nèi)，溶液顏色的深淺與可溶性糖含量成正比。利用此反應(yīng)與同樣處理的已知葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)溶液比色，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法(直接比較法)即可計(jì)算出樣品中糖原的含量。糖原在濃堿溶液中非常穩(wěn)定，故在顯色之前，肝組織先谿于濃堿

4、中加熱，以破壞其它成分，而保留肝糖原。三、材料與方法：以流程圖示意1、材料：(1)樣品：雞肝(2)試劑：95%乙醇、5% (W/V)三氯乙酸、濃鹽酸、12.5mol/L (50%) NaOH溶液、 碘試劑、班氏試劑、5.35mol/L (30%) KOH溶液、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液(50mg/L)、慈酮顯 色劑(3)儀器和器材：普通離心機(jī)、室溫-100C恒溫水浴箱、可見(jiàn)光分光光度計(jì)、托盤天 平、剪刀、銀子、研缽、試管架、離心管、試管、100mm*15mm試管、刻度吸量管(2ml、 5ml)、1000仙l微量可調(diào)取液器、100ml容量瓶、白瓷反應(yīng)板2、方法：(1)肝糖原的提取與鑒定w加碘試劑2滴糖原溶液2

5、滴沉淀（棄去）上清液（取2ml）+2ml 95%乙醇，混勻，靜置w加碘試劑2滴糖原溶液2滴沉淀（棄去）上清液（取2ml）+2ml 95%乙醇，混勻，靜置10min離心 5min ( 4000r/min )上清液（棄去）沉淀沸水浴2min ,溶解沉淀白瓷板孔穴中糖原溶液1ml1 W +濃HCL5滴加碘試劑2滴 沸水浴15min,冷卻_IW呈色對(duì)比+50%NaOH 5滴糖原水解液2滴糖原水解液+班氏試劑4滴混勻沸水浴2min,觀察變化（2）肝糖原定量測(cè)定四、結(jié)果與討論： 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、現(xiàn)象、圖譜；討論：以結(jié)果為基礎(chǔ)的邏輯推論，并得出結(jié)論。1、結(jié)果：(1)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：1)肝糖原的提取與鑒定第一次離心

6、后，肝勻漿分為2層，上層為上清液，不完全澄清，下層為淡褐色沉淀圖1肝勻漿圖2肝勻漿第一次離心后加入乙醇混勻并靜置后，溶液分層，上層為上清液，下層有白色絮狀沉淀。第二次離心后，溶液分為圖1肝勻漿圖2肝勻漿第一次離心后加入乙醇混勻并靜置后，溶液分層，上層為上清液，下層有白色絮狀沉淀。第二次離心后，溶液分為2層，上層為上清液，試管底部有少量白色沉淀加入蒸儲(chǔ)水并沸水浴后，白色沉淀溶解。白瓷板上，糖原溶液加碘試劑后呈紅棕色，與碘自身的黃色有明顯區(qū)別圖4呈色對(duì)比結(jié)果（左為糖原溶液加碘試劑，右為碘試劑）往糖原水解液中加入班氏試劑后，溶液呈藍(lán)色（班氏試劑本身為藍(lán)色）。沸水浴后,溶液變?yōu)榇u紅色（生成磚紅色沉淀）

7、。圖5糖原水解液圖6沸水浴前醇紅色沉淀圖5糖原水解液圖6沸水浴前醇紅色沉淀圖7沸水浴后2）肝糖原定量測(cè)定往雞肝中加入KOH并沸水浴后，溶液變?yōu)榧t棕色。圖8沸水浴后，溶液變?yōu)榧t棕色水浴前，空白管呈黃色，標(biāo)準(zhǔn)管呈綠色，樣品管呈黃色（顏色比空白管淺）。水浴后,空白管無(wú)明顯變化，標(biāo)準(zhǔn)管顏色略變深，樣品管由黃色變?yōu)樯罹G色（顏色比標(biāo)準(zhǔn)管深）（2）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù):圖9水浴前圖10水浴后測(cè)定次數(shù)標(biāo)準(zhǔn)管樣品管10.5930.40120.5930.39730.5940.396平均值0.5930.398表1標(biāo)準(zhǔn)管和樣品管測(cè)得的吸光度（A620）及平均值按下式計(jì)算樣品中肝糖原的含量：肝糖原（g/100g 肝組織）= * 0

8、.05 * * * 1.11A標(biāo)準(zhǔn)肝組織重（g）1000由于樣品稀釋了一倍，因此計(jì)算結(jié)果需乘二。結(jié)果：肝糖原的含量為4.966g/100g肝組織。故本次實(shí)驗(yàn)結(jié)論為：該雞肝樣品含有肝組織，且肝糖原含量為4.966g/100g肝組織。2、討論：（1）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析：本次實(shí)驗(yàn)測(cè)得肝糖原含量為4.966g/100g肝組織。查書得飽食雞肝肝糖原含量為23g/100g肝組織。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏大，說(shuō)明肝組織中含有過(guò)多肝糖原，試驗(yàn)所用雞肝為脂肪肝。(2)呈色對(duì)比結(jié)果分析：糖原溶液與碘試劑反應(yīng)呈紅棕色，與碘試劑本身的黃色區(qū)別 明顯，說(shuō)明糖原含量較大。(3)糖原水解液與班氏試劑反應(yīng)結(jié)果分析：該反應(yīng)主要是通過(guò)檢測(cè)葡萄糖與班氏試劑 的還原性糖反應(yīng)間接鑒定溶液中糖原的存在。糖原溶液被濃鹽酸水解為葡萄糖，葡萄糖 中的醛基可被Cu(OH)2氧化為竣基，即把葡萄糖氧化為葡萄糖酸，Cu2+則被還原生成CU2O磚紅色沉淀。因此水浴后，溶液由藍(lán)色變?yōu)榇u紅色，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象明顯。(4)注意事項(xiàng)：1)慈酮試劑為濃硫酸所配制，使用時(shí)應(yīng)小心謹(jǐn)慎。若不慎沾到皮膚上，應(yīng)立即用大量 清水沖洗。2)離心后，用移液槍吸取上清液時(shí)應(yīng)避免槍頭觸及沉淀，否則會(huì)使沉淀物上浮，導(dǎo)致 上清液渾濁。避免將槍頭伸到液面下再按按鈕，否則槍頭噴出的氣泡也會(huì)激起沉淀物。3)打開(kāi)室溫-100C恒溫水浴箱蓋子時(shí)要小心水蒸氣，以免燙傷。4)使用離心機(jī)時(shí)要注意配