微生物發(fā)酵產(chǎn)酶

1、第四章 微生物發(fā)酵產(chǎn)酶及生產(chǎn)工藝常用的產(chǎn)酶微生物；發(fā)酵工藝條件及其控制；酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)；固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶；固定化微生物原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶； 內(nèi)容：第一節(jié) 常用的產(chǎn)酶微生物一、應(yīng)用微生物來(lái)開(kāi)發(fā)酶的優(yōu)點(diǎn)： (1)微生物生長(zhǎng)繁殖快，生活周期短。因此，用微生物來(lái)生產(chǎn)酶產(chǎn)品，生產(chǎn)能力（發(fā)酵）幾乎可以不受限制地?cái)U(kuò)大，能夠滿足迅速擴(kuò)張的市場(chǎng)需求。 (2)微生物種類(lèi)繁多，它們散布于整個(gè)地球的各個(gè)角落，而且在不同的環(huán)境下生存的微生物都有其完全不同的代謝方式，能分解利用不同的底物。 (3)這一特征就為微生物酶品種的多樣性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。 (4)特別是當(dāng)基因工程介入時(shí)，動(dòng)植物細(xì)胞中存在地酶，幾乎都能夠利用微生物

2、細(xì)胞獲得。 因此，有計(jì)劃和仔細(xì)地篩選微生物菌種，通?？梢垣@得能夠生產(chǎn)幾乎任何一種酶的適當(dāng)細(xì)胞。二、用于酶生產(chǎn)微生物的要求：1、酶的產(chǎn)量高；2、容易培養(yǎng)和管理；3、產(chǎn)酶穩(wěn)定性好；4、利于分離純化；5、安全可靠、無(wú)毒性。(1) 大腸埃希氏桿菌，簡(jiǎn)稱(chēng)為大腸桿菌，是最為著名的原核生物。形態(tài)：短桿或長(zhǎng)桿狀，0.51.01.03.0 um，革蘭氏陰性，運(yùn)動(dòng)(周毛)或不運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽孢，一般無(wú)莢膜。菌落呈白色至黃白色，擴(kuò)展，光滑，閃光。Escherich屬菌株和大多數(shù)大腸桿菌是無(wú)害，但也有些大腸桿菌是致病的，會(huì)引起腹瀉和尿路感染。大腸桿菌的名聲主要因它易于在實(shí)驗(yàn)室操作、生長(zhǎng)迅速，而且營(yíng)養(yǎng)要求低。應(yīng)用：大腸桿菌能

3、作為宿主供大量的細(xì)菌病毒生長(zhǎng)繁殖大腸桿菌也是最早用作基因工程的宿主菌工業(yè)上生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶和 制備天冬氨酸、蘇氨酸及纈氨酸等三、常見(jiàn)產(chǎn)酶微生物 (2) 醋酸桿菌（Acetobacter） 菌體從橢圓至桿狀，單個(gè)、成對(duì)或成鏈，革蘭氏陰性，運(yùn)動(dòng)（周毛）或不運(yùn)動(dòng)，不生芽孢。好氣。含糖、乙醇和酵母膏的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。應(yīng)用：有機(jī)酸(食醋等）葡萄糖異構(gòu)酶(高果糖漿 )山梨糖 (維C中間體） (3)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） 直狀、近直狀的桿菌，周生或側(cè)生鞭毛，革蘭氏陽(yáng)性，無(wú)莢膜，芽孢0.51.51.8m，中生或近中生?？莶菅挎邨U菌是工業(yè)發(fā)酵的重要菌種之一。生產(chǎn)淀粉酶、

4、蛋白酶、5-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。(4) 根霉(Rhizopus) 分類(lèi)學(xué)上屬于藻狀菌綱，毛霉目，根霉屬。 根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培養(yǎng)基上固著，并吸收營(yíng)養(yǎng)）。分布于土壤、空氣中，常見(jiàn)于淀粉食品上，可引起霉腐變質(zhì)和水果、蔬菜的腐爛。代表種：米根霉（R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。應(yīng)用：根霉能產(chǎn)生一些酶類(lèi)，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等，是生產(chǎn)這些酶類(lèi)的菌種。在釀酒工業(yè)上常用做糖化菌。有些根霉還能產(chǎn)生乳酸、延胡索酸等有機(jī)酸。(5)曲霉(Aspergillus) 分類(lèi)：多數(shù)屬于子囊菌亞門(mén)，少數(shù)屬于半知菌亞門(mén)。分布：廣泛分布于土壤、空氣和谷物上，可引

5、起食物、谷物和果蔬的霉腐變質(zhì)，有的可產(chǎn)生致癌性的黃曲霉毒素。代表種：黑曲霉Asp. Niger、黃曲霉Asp.flavus應(yīng)用：是制醬、釀酒、制醋的主要菌種。是生產(chǎn)酶制劑（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶）的菌種。生產(chǎn)有機(jī)酸（如檸檬酸、葡萄糖酸等）。農(nóng)業(yè)上用作生產(chǎn)糖化飼料的菌種?；乇竟?jié)第二節(jié)、微生物酶開(kāi)發(fā)的一般程序(一) 樣品的采集 采樣的目的、采樣地點(diǎn)、采樣方法及采樣的數(shù)量。微生物酶開(kāi)發(fā)的一般程序(二) 菌種的分離 培養(yǎng)基的確定、培養(yǎng)條件的確定。微生物酶開(kāi)發(fā)的一般程序(三) 菌種的初篩 (1)用簡(jiǎn)單的定性反應(yīng)進(jìn)行初篩； (2)在最初分離階段就給予特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，進(jìn)而讓目的菌株得以繁殖，盡可能地

6、把只成為目的菌的菌株或只將其最適菌株的一株純化分離。微生物酶開(kāi)發(fā)的一般程序(四) 菌種的復(fù)篩 初篩之后，還要進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩的目的是在初篩的基礎(chǔ)上，篩選產(chǎn)酶量高、性能更符合生產(chǎn)要求的菌種。復(fù)篩。 酶活的測(cè)定方法的建立尤其重要。微生物酶開(kāi)發(fā)的一般程序(五) 對(duì)復(fù)篩獲得菌株的要求 (1)不是致病菌； (2)菌株不易變易和退化； (3)不易感染噬菌體； (4)微生物產(chǎn)酶量高； (5)酶的性質(zhì)符合應(yīng)用的需要，而且最好是胞外酶； (6)產(chǎn)生的酶便于分離和提取，得率高； (7)微生物培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求低。微生物酶開(kāi)發(fā)的一般程序(六) 最佳產(chǎn)酶條件的初步確定 (1)培養(yǎng)方式的確定； (2)最佳培養(yǎng)條件組合； (3)

7、微生物產(chǎn)酶的特性(胞內(nèi)酶、胞外酶)； (4)微生物酶收集的時(shí)間順序； 微生物酶開(kāi)發(fā)的一般程序(七) 微生物產(chǎn)酶性能的進(jìn)一步提高 (1)獲得高產(chǎn)菌種的突變體； 微生物酶開(kāi)發(fā)的一般程序(七) 微生物產(chǎn)酶性能的進(jìn)一步提高 (2)利用代謝工程和代謝調(diào)節(jié)機(jī)理來(lái)提高微生物的酶產(chǎn)量； 微生物酶開(kāi)發(fā)的一般程序(七) 微生物產(chǎn)酶性能的進(jìn)一步提高 (3)運(yùn)用遺傳工程、基因工程的手段將原有菌株中的目的基因轉(zhuǎn)移到另外一些對(duì)生產(chǎn)環(huán)境更適應(yīng)性的微生物細(xì)胞之內(nèi)，使其高效表達(dá)； 微生物酶開(kāi)發(fā)的一般程序(八) 微生物酶的提取方法 (1)酶的粗提； (2)酶的精制。 微生物酶開(kāi)發(fā)的一般程序(九) 微生物產(chǎn)酶菌種的保藏 (1)斜面

8、； (2)沙土管； (3)冷凍。 -淀粉酶的篩選蛋白酶產(chǎn)生菌的獲得方法應(yīng)用含酪蛋白的培養(yǎng)基第三節(jié)、發(fā)酵工藝條件及其控制1、培養(yǎng)基2、發(fā)酵條件及控制3、提高產(chǎn)酶的措施GoGoGo下一節(jié)本章目錄1、培養(yǎng)基培養(yǎng)基：是指人工配制的用于細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。分類(lèi) 水分和形態(tài) 形狀 用途各種生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求1、選擇適宜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)2、營(yíng)養(yǎng)物的濃度及配比合適3、物理、化學(xué)條件適宜4、經(jīng)濟(jì)節(jié)約5、精心設(shè)計(jì)、試驗(yàn)比較培養(yǎng)不同的微生物必須采用不同的培養(yǎng)條件；培養(yǎng)目的不同，原料的選擇和配比不同；不同階段，培養(yǎng)條件也有所差異。培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)原則五大要素：碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、水培養(yǎng)基幾乎是一切對(duì)微

9、生物進(jìn)行研究和利用工作的基礎(chǔ)任何培養(yǎng)基都應(yīng)該具備微生物生長(zhǎng)所需要五大營(yíng)養(yǎng)要素構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中碳架 碳源可作能源，為生命活動(dòng)提供能量常用碳源：糖類(lèi)、醇類(lèi)、脂類(lèi)、有機(jī)酸、烴類(lèi)、蛋白質(zhì)及其降解物異養(yǎng)微生物：糖類(lèi)是最好碳源（葡萄糖最為通用） 水是微生物最基本的組成分（）水是微生物體內(nèi)和體外的溶劑（吸收營(yíng)養(yǎng)成分和代謝廢物）水是細(xì)胞質(zhì)組分，直接參與各種代謝活動(dòng)調(diào)節(jié)細(xì)胞溫度和保持環(huán)境溫度的穩(wěn)定（比熱高，傳熱快）水碳源選擇合適碳源，以適應(yīng)目的酶的合成調(diào)節(jié)機(jī)制構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物中氮元素氮源有機(jī)氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏無(wú)機(jī)氮源銨鹽、硝酸鹽 參與酶的組成、構(gòu)成酶活性基、激活酶活性維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性調(diào)

10、節(jié)細(xì)胞滲透壓控制細(xì)胞的氧化還原電位 常用：硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物以及含有鉀、鈉、鈣、鎂、鐵等元素的化合物。 氮源無(wú)機(jī)鹽需要注意合適的碳氮比生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物質(zhì)進(jìn)行合成，而必須另外加入少量的生長(zhǎng)需求的有機(jī)物質(zhì)。 分類(lèi)：化學(xué)結(jié)構(gòu)分成維生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和類(lèi)脂成分 等四類(lèi)功能：以輔酶與輔基的形式參與代謝中的酶促反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作為各種生長(zhǎng)因子的的需要，麥芽汁、米曲汁等天然培養(yǎng)基中本身含有各種生長(zhǎng)因子 實(shí)驗(yàn)室的常用培養(yǎng)基：細(xì)菌： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（或簡(jiǎn)稱(chēng)普通肉湯培養(yǎng)基）；放線菌：高氏1號(hào)合成培養(yǎng)基培養(yǎng)；酵母菌：麥芽汁培

11、養(yǎng)基；霉菌： 查氏合成培養(yǎng)基；例如枯草芽孢桿菌：一般培養(yǎng)：肉湯培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基；自然轉(zhuǎn)化：基礎(chǔ)培養(yǎng)基；觀察芽孢：生孢子培養(yǎng)基；產(chǎn)蛋白酶：以玉米粉、黃豆餅粉為主的產(chǎn)酶培養(yǎng)基；枯草桿菌BF7658-淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉8%，豆餅粉4%，磷酸氫二鈉 0.8%，硫酸銨0.4%，氯化鈣0.2%，氯化按0.15%（自然pH）?？莶輻U菌AS1.398中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉4%，豆餅粉3%，麩皮3.2%, 糠1%, 磷酸氫二鈉0.4%, 磷酸二氫鉀0.03%（自然pH）。黑曲霉糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉10%，豆餅粉4%，麩皮1%（pH4.45.0）。地衣芽孢桿菌2709堿性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉

12、5.5%, 豆餅4%, 磷酸氫二鈉0.4%, 磷酸二氫鉀0.03%(pH 8.5)。黑曲霉AS 3.350酸性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基: 玉米粉6%, 豆餅粉4%, 玉米漿0.6%, 氯化鈣0.5%, 氯化銨1%, 磷酸氫二鈉0.2% (pH 5.5)。 游動(dòng)放線菌葡萄糖異構(gòu)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜2%，豆餅粉2%，磷酸氫二鈉0。1%，硫酸鎂0。05% (pH 7.2)。桔青霉磷酸二酯酶發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%, 硫酸鎂0.05%, 氯化鈣0.04%, 磷酸氫二鈉0.05%, 磷酸二氫鉀0.05% (自然pH)。黑曲霉AS3.396果膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基: 麩皮5%, 果膠0.3%, 硫酸銨2%

13、, 磷酸二氫鉀0.25%, 硫酸鎂0.05%, 硝酸鈉0.02%, 硫酸亞鐵0.001% (自然pH)。枯草桿菌AS1.398堿性磷酸酶發(fā)酵培養(yǎng)基: 葡萄糖0.4%, 乳蛋白水解物0.1%, 硫酸銨1%, 氯化鉀0.1%, 氯化鈣0.1mmol/L, 氯化鎂1.0mmol/L, 磷酸氫二鈉20mol/L ( 用pH7.4的Tris-HCl緩沖液配制)回本節(jié)2、發(fā)酵條件及控制培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內(nèi)，以滿足不同類(lèi)型微生物的生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。為了維持培養(yǎng)基pH的相對(duì)恒定，通常在培養(yǎng)基中加入pH緩沖劑，或在進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵時(shí)補(bǔ)加酸、堿。通常培養(yǎng)條件：細(xì)菌與放線菌：pH6.58.0酵母菌和

14、霉菌：pH46范圍內(nèi)生長(zhǎng)pH值的控制細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH值與生長(zhǎng)最適pH值往往有所不同。細(xì)胞生產(chǎn)某種酶的最適pH值通常接近于該酶催化反應(yīng)的最適pH值。 有些細(xì)胞可以同時(shí)產(chǎn)生若干種酶，在生產(chǎn)過(guò)程中，通過(guò)控制培養(yǎng)基的pH值，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。 一般工藝流程P46pH對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖和代謝產(chǎn)物形成影響的主要原因：1、影響原生質(zhì)膜的性質(zhì)2、影響酶的活性3、影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和中間代謝產(chǎn)物的解離二、影響pH值變化的因素1、基質(zhì)代謝（1）糖代謝 特別是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是補(bǔ)料的標(biāo)志之一（2）氮代謝 當(dāng)氨基酸中的-NH2被利用后pH會(huì)下降；尿素被分解

15、成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，當(dāng)碳源不足時(shí)氮源當(dāng)碳源利用pH上升。（3）生理酸堿性物質(zhì)利用后pH會(huì)上升或下降 2、產(chǎn)物形成 某些產(chǎn)物本身呈酸性或堿性，使發(fā)酵液pH變化。如有機(jī)酸類(lèi)產(chǎn)生使pH下降，紅霉素、潔霉素、螺旋霉素等抗生素呈堿性，使pH上升。3、菌體自溶，pH上升，發(fā)酵后期，pH上升。三、發(fā)酵過(guò)程pH值的調(diào)節(jié)及控制1、調(diào)整培養(yǎng)基的組分2、在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行控制添加CaCO3： 氨水流加法 尿素流加法 3、通過(guò)補(bǔ)料調(diào)pH4、當(dāng)補(bǔ)料與調(diào)pH發(fā)生矛盾時(shí)，加酸堿調(diào)pH例： 配制不同初始pH的培養(yǎng)基，搖瓶考察發(fā)酵情況pH對(duì)產(chǎn)海藻酸裂解酶的影響例子：不同調(diào)pH方法的影響分別在4種緩沖介質(zhì)中，

16、于pH 650一950測(cè)定天冬酰胺酶酶活力1 甘氨酸介質(zhì)pH 8.00時(shí)酶活力最高；2 硼酸在pH 8.50，酶反應(yīng)最快3 磷酸在pH 8.50，酶反應(yīng)最快4 Tris在pH 8.50，酶反應(yīng)最快酶活1243 不同pH控制方式對(duì)目的突變株ISw330異亮氨酸搖瓶發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖所示。 “1”表示只加CaC03控制pH值，“2”表示只加尿素控制，“3”表示CaC03和尿素聯(lián)合控制pH值。異亮氨酸發(fā)酵 不同pH值對(duì)菌體的形態(tài)影響很大，當(dāng)pH值高于75時(shí)，菌體易于老化，呈現(xiàn)球狀；當(dāng)pH值低于65時(shí)菌體同樣受抑制，易于老化。而在72左右時(shí)，菌體是處于產(chǎn)酸期，呈現(xiàn)長(zhǎng)的橢圓形；在69左右時(shí)，菌體處于生

17、長(zhǎng)期，呈“八”字形狀并占有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)。 pH69時(shí)，菌體生長(zhǎng)旺盛，pH7.15時(shí)，對(duì)菌體的產(chǎn)酸有利。因此，在發(fā)酵的產(chǎn)酸期產(chǎn)酸較高。采用階段pH控制模式進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵中前期控制pH6.9，到48h后pH值為7.15，到80h后pH值為7.25。產(chǎn)率22.27g/L，產(chǎn)酸率提高12.23。通常在生物學(xué)范圍內(nèi)每升高10，生長(zhǎng)速度就加快一倍，所以溫度直接影響酶反應(yīng)，對(duì)于微生物來(lái)說(shuō)，溫度直接影響其生長(zhǎng)和合成酶。溫度的控制有些細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度與細(xì)胞生長(zhǎng)最適溫度有所不同，而且往往低于生長(zhǎng)最適溫度。這是由于在較低的溫度條件下，可以提高酶所對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，增加酶生物合成的延續(xù)時(shí)間，從而提高酶的產(chǎn)

18、量。 枯草桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為3437黑曲霉的最適生長(zhǎng)溫度為2832 溶解氧的控制溶解氧是指溶解在培養(yǎng)基中的氧氣。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中， 處于不同生長(zhǎng)階段的細(xì)胞，其細(xì)胞濃度和細(xì)胞呼吸強(qiáng)度各不相同，致使耗氧速率有很大的差別。因此必須根據(jù)耗氧量的不同，不斷供給適量的溶解氧。培養(yǎng)液中溶解氧的量，決定于在一定條件下氧氣的溶解速度。溶氧速率與通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時(shí)間、氣液接觸面積以及培養(yǎng)液的性質(zhì)等有密切關(guān)系。一般說(shuō)來(lái)，通氣量越大、氧氣分壓越高、氣液接觸時(shí)間越長(zhǎng)、氣液接觸面積越大，則溶氧速率越大。培養(yǎng)液的性質(zhì)，主要是黏度、氣泡、以及溫度等對(duì)于溶氧速率有明顯影響。調(diào)節(jié)通氣量調(diào)節(jié)氧的分壓 調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)

19、間 調(diào)節(jié)氣液接觸面積 改變培養(yǎng)液的性質(zhì) 控制溶解氧方法回本節(jié)3、提高酶產(chǎn)量的措施 1、添加誘導(dǎo)物對(duì)于誘導(dǎo)酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵過(guò)程中的某個(gè)適宜的時(shí)機(jī)，添加適宜的誘導(dǎo)物，可以顯著提高酶的產(chǎn)量。例如，乳糖誘導(dǎo)-半乳糖苷酶，纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶，蔗糖甘油單棕櫚酸誘導(dǎo)蔗糖酶的生物合成等。 誘導(dǎo)物一般可以分為3類(lèi)（誘導(dǎo)物定義） 酶的作用底物 酶的催化反應(yīng)產(chǎn)物 作用底物的類(lèi)似物2、控制阻遏物的濃度阻遏作用根據(jù)機(jī)理不同，可分為：產(chǎn)物阻遏和分解代謝物阻遏兩種。1.產(chǎn)物阻遏作用是由酶催化作用的產(chǎn)物或者代謝途徑的末端產(chǎn)物引起的阻遏作用。2.分解代謝物阻遏作用是由分解代謝物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物質(zhì)經(jīng)過(guò)分解

20、代謝而產(chǎn)生的物質(zhì)）引起的阻遏作用?？刂谱瓒粑锏臐舛仁墙獬瓒?、提高酶產(chǎn)量的有效措施。 為了減少或者解除分解代謝物阻遏作用，應(yīng)當(dāng)控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度。采用其他較難利用的碳源，如淀粉等采用補(bǔ)料、分次流加碳源添加一定量的環(huán)腺苷酸（cAMP）對(duì)于受代謝途徑末端產(chǎn)物阻遏的酶，可以通過(guò)控制末端產(chǎn)物的濃度的方法使阻遏解除。 3、添加表面活性劑表面活性劑可以與細(xì)胞膜相互作用，增加細(xì)胞的透過(guò)性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產(chǎn)量。 將適量的非離子型表面活性劑，如吐溫（Tween）、特里頓(Triton)等添加到培養(yǎng)基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產(chǎn)量增加。 由于離子型表面活性劑對(duì)細(xì)胞有

21、毒害作用，尤其是季胺型表面活性劑（如新潔而滅等）是消毒劑，對(duì)細(xì)胞的毒性較大，不能在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中添加到培養(yǎng)基中。 回本節(jié)4、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指可以促進(jìn)產(chǎn)酶、但是作用機(jī)理未闡明清楚的物質(zhì)。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高120倍；添加聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol）可以提高糖化酶的產(chǎn)量。產(chǎn)酶促進(jìn)劑對(duì)不同細(xì)胞、不同酶的作用效果各不相同，現(xiàn)在還沒(méi)有規(guī)律可循，要通過(guò)試驗(yàn)確定所添加的產(chǎn)酶促進(jìn)劑的種類(lèi)和濃度。怎樣優(yōu)化培養(yǎng)基？培養(yǎng)基優(yōu)化是工業(yè)發(fā)酵永恒不變的主題。！補(bǔ)充知識(shí)：試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)中，發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)是十分重要的，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的

22、成分對(duì)產(chǎn)物濃度、菌體生長(zhǎng)都有重要的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法發(fā)展至今可供人們根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要來(lái)選擇的余地也很大。 單因素法（One at a time） 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（Orthogonal design）均勻設(shè)計(jì) (Uniform design) 全因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Full factorial design) 部分因子設(shè)計(jì)(fractional factorial design) Plackett-Burman設(shè)計(jì)（Plackett-Burman design） 中心組合設(shè)計(jì)（Central composite design）BoxBehnken設(shè)計(jì)(BoxBehnken design) 最優(yōu)化技術(shù)（實(shí)驗(yàn)統(tǒng)

23、計(jì)） 響應(yīng)曲面分析法 改進(jìn)單純形優(yōu)化法(Modified simplex method) 遺傳算法(Genetic algorithm，GA) 第三節(jié)、 酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)1、酶生物合成的模式2、酶生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)3、酶生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)GoGoGo本章目錄一、研究?jī)?nèi)容及意義內(nèi)容：發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)速度、產(chǎn)物生成速度、基質(zhì)消耗速度以及環(huán)境因素對(duì)這些速度的影響等。意義：在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，研究細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和發(fā)酵產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)，對(duì)于了解酶的生物合成模式，發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化控制，提高酶的產(chǎn)率等方面均具有重要意義。前題：如何測(cè)定細(xì)胞量？1、計(jì)數(shù)法 濁度計(jì)比濁法 測(cè)定稀的細(xì)胞懸液的透光量，間接測(cè)出細(xì)

24、胞數(shù)量的生長(zhǎng) 。計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法 在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)器直接數(shù)出酵母菌或霉菌孢子數(shù)目，以及用細(xì)菌計(jì)數(shù)片直接測(cè)出細(xì)菌數(shù)的生長(zhǎng) 。2、測(cè)定細(xì)胞重量細(xì)胞干重稱(chēng)量法 直接測(cè)定單位體積培養(yǎng)物的細(xì)胞干重，由此代表菌體細(xì)胞物質(zhì)總量。細(xì)胞堆積容積測(cè)量法 （離心壓縮細(xì)胞體積法） 用刻度錐形管測(cè)量經(jīng)離心的細(xì)胞沉淀物的容積 ，由此間接表示細(xì)胞重量。細(xì)胞組成分析法 測(cè)定一種大分子的細(xì)胞組成(如蛋白質(zhì)、RNA、DNA等)，間接算出細(xì)胞的重量。 營(yíng)養(yǎng)物消耗分析法 測(cè)定培養(yǎng)基中不用于合成代謝產(chǎn)物的營(yíng) 養(yǎng)物（磷酸鹽、硫酸鹽等）的消耗，由此間接表示生長(zhǎng)的細(xì)胞重量。產(chǎn)物重量分析法 測(cè)定培養(yǎng)中間形成的二氧化碳，氫，ATP 等產(chǎn)物，由此

25、間接換算出生長(zhǎng)的細(xì)胞重量。二、酶生物合成的模式細(xì)胞在一定條件下培養(yǎng)生長(zhǎng)， 其生長(zhǎng)過(guò)程一般經(jīng)歷調(diào)整期、生長(zhǎng)期、平衡期和衰退期等4個(gè)階段 通過(guò)分析比較細(xì)胞生長(zhǎng)與酶產(chǎn)生的關(guān)系, 可以把酶生物合成的模式分為4種類(lèi)型。即同步合成型，延續(xù)合成型，中期合成型和滯后合成型。 同步合成型 酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步進(jìn)行的一種酶生物合成模式。該類(lèi)型酶的生物合成速度與細(xì)胞生長(zhǎng)速度緊密聯(lián)系， 又稱(chēng)為生長(zhǎng)偶聯(lián)型。 屬于該合成型的酶，其生物合成伴隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)而開(kāi)始；在細(xì)胞進(jìn)入旺盛生長(zhǎng)期時(shí)，酶大量生成；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶的合成隨著停止。 大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導(dǎo)酶也按照此種模式進(jìn)行生物合成

26、。 例如米曲霉在含有單寧或者沒(méi)食子酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在單寧或沒(méi)食子酸的誘導(dǎo)作用下，合成單寧酶（tanase EC3.1.1.20）。 細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml總細(xì)胞濃度 活細(xì)胞濃度胞外酶濃度 胞內(nèi)酶濃度延續(xù)合成型 酶的生物合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開(kāi)始，在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成一段較長(zhǎng)時(shí)間。 屬于該類(lèi)型的酶可以是組成酶，也可以是誘導(dǎo)酶。例如， 在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果膠為單一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。 細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml以半乳糖醛酸為誘導(dǎo)物

27、以含有葡萄糖的果膠為誘導(dǎo)物 中期合成型 該類(lèi)型的酶在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間以后才開(kāi)始，而在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶的生物合成也隨著停止。 細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml 例如，枯草桿菌堿性磷酸酶（Alkaline phophatase，EC 3.1.3.1)的生物合成模式屬于中期合成型。這是由于該酶的合成受到其反應(yīng)產(chǎn)物無(wú)機(jī)磷酸的反饋?zhàn)瓒?，而磷又是?xì)胞生長(zhǎng)所必不可缺的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基中必須有磷的存在。這樣， 在細(xì)胞生長(zhǎng)的開(kāi)始階段, 培養(yǎng)基中的磷阻遏堿性磷酸酶的合成，只有當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間， 培養(yǎng)基中的磷幾乎被細(xì)胞用完（低于0.01mmol/L）以后，該酶才開(kāi)始大量生成。又由于堿性磷酸酶所對(duì)應(yīng)的mR

28、NA不穩(wěn)定，其壽命只有30 min左右，所以當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入平衡期后， 酶的生物合成隨著停止。滯后合成型 此類(lèi)型酶是在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間或者進(jìn)入平衡期以后才開(kāi)始其生物合成并大量積累。又稱(chēng)為非生長(zhǎng)偶聯(lián)型。許多水解酶的生物合成都屬于這一類(lèi)型。 屬于滯后合成型的酶，之所以要在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間甚至進(jìn)入平衡期以后才開(kāi)始合成，主要原因是由于受到培養(yǎng)基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)，阻遏物幾乎被細(xì)胞用完而使阻遏解除后，酶才開(kāi)始大量合成。 若培養(yǎng)基中不存在阻遏物，該酶的合成可以轉(zhuǎn)為延續(xù)合成型。該類(lèi)型酶所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性很好，可以在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后的相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，繼續(xù)進(jìn)行酶的生物合成。黑曲霉

29、羧基蛋白酶生物合成 放線菌素D 對(duì)產(chǎn)酶的影響細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml酶濃度U/ml酶濃度U/ml3022不加加入不加加入理想的酶合成模式酶所對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性以及培養(yǎng)基中阻遏物的存在是影響酶生物合成模式的主要因素。其中，mRNA穩(wěn)定性好的，可以在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，繼續(xù)合成其所對(duì)應(yīng)的酶；mRNA穩(wěn)定性差的，就隨著細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期而停止酶的生物合成；不受培養(yǎng)基中存在的某些物質(zhì)阻遏的，可以伴隨著細(xì)胞生長(zhǎng)而開(kāi)始酶的合成；受到培養(yǎng)基中某些物質(zhì)阻遏的，則要在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間甚至在平衡期后， 酶才開(kāi)始合成并大量積累?；乇竟?jié)在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，為了提高產(chǎn)酶率和縮短發(fā)酵周期，最理想的合成模式應(yīng)

30、是延續(xù)合成型。因?yàn)閷儆谘永m(xù)合成型的酶，在發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有生長(zhǎng)期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細(xì)胞一開(kāi)始生長(zhǎng)就有酶產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶還可以繼續(xù)合成一段較長(zhǎng)的時(shí)間。對(duì)于其他合成模式的酶，可以通過(guò)基因工程細(xì)胞工程等先進(jìn)技術(shù),選育得到優(yōu)良的菌株, 并通過(guò)工藝條件的優(yōu)化控制, 使他們的生物合成模式更加接近于延續(xù)合成型。其中對(duì)于同步合成型的酶，要盡量提高其對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，為此適當(dāng)降低發(fā)酵溫度是可取的措施；對(duì)于滯后合成型的酶，要設(shè)法降低培養(yǎng)基中阻遏物的濃度 ，盡量減少甚至解除產(chǎn)物阻遏或分解代謝物阻遏作用，使酶的生物合成提早開(kāi)始；而對(duì)于中期合成型的酶，則要在提高mRNA的穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面

31、下功夫，使其生物合成的開(kāi)始時(shí)間提前， 并盡量延遲其生物合成停止的時(shí)間。三、酶生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)細(xì)胞在控制一定條件的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的過(guò)程中,其生長(zhǎng)速度受到細(xì)胞內(nèi)外各種因素的影響,變化比較復(fù)雜，情況各不相同。 細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)主要研究細(xì)胞生長(zhǎng)速度以及外界環(huán)境因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速度影響的規(guī)律。1950年，法國(guó)的莫諾德(Monod)首先提出了表述微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)方程。 在培養(yǎng)過(guò)程中， 細(xì)胞生長(zhǎng)速率與細(xì)胞濃度成正比 假設(shè)培養(yǎng)基中只有一種限制性基質(zhì)，而不存在其他生長(zhǎng)限制因素時(shí)，為這種限制性基質(zhì)濃度的函數(shù)。KS 為莫諾德常數(shù)， 是指比生長(zhǎng)速率達(dá)到最大比生長(zhǎng)速率一半時(shí)的限制性基質(zhì)濃度。無(wú)抑制的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力

32、學(xué) Monod方程 現(xiàn)代細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的奠基人Monod在1942年便指出，在培養(yǎng)基中無(wú)抑制劑存在的情況下，細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率與限制性基質(zhì)濃度的關(guān)系可用下式表示：該方程中 為比生長(zhǎng)速率(s-1)； 為最大比生長(zhǎng)速率(s-1 ， min-1 ，h-1)， S為限制性基質(zhì)濃度(g/L)；Ks為飽和常數(shù)(g/L)，其值等于比生長(zhǎng)速率為最大比生長(zhǎng)速率一半時(shí)的限制性基質(zhì)濃度。Monod方程是典型的均衡生長(zhǎng)模型，其基本假設(shè)如下： 細(xì)胞的生長(zhǎng)為均衡式生長(zhǎng)，因此描述細(xì)胞生長(zhǎng)的唯一變量是細(xì)胞的濃度；培養(yǎng)基中只有一種基質(zhì)是生長(zhǎng)限制性基質(zhì)，而其它組分為過(guò)量不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)； 細(xì)胞的生長(zhǎng)視為簡(jiǎn)單的單一反應(yīng)，細(xì)胞得率為一

33、常數(shù)。 細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率與限制性基質(zhì)濃度的關(guān)系S 當(dāng)限制性基質(zhì)濃度很低時(shí)，S Ks時(shí)，=m，若繼續(xù)提高基質(zhì)濃度，細(xì)胞生長(zhǎng)速率基本不變。此時(shí)細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率與基質(zhì)濃度無(wú)關(guān)，為零級(jí)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。 將Monod方程式變?yōu)闉橹本€方程。不同的菌種，不同的培養(yǎng)基，Ks和 是不同的。 Monod方程雖然表述簡(jiǎn)單，但它不足以完整地說(shuō)明復(fù)雜的生化反應(yīng)過(guò)程，并且已發(fā)現(xiàn)它在某些情況下與實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符，因此人們又提出了另外一些方程。 單基質(zhì)限制的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型四、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué) 產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)主要研究細(xì)胞產(chǎn)酶速率以及各種環(huán)境因素對(duì)產(chǎn)酶速率的影響規(guī)律。產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)的研究可以從整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)著眼，研究群體細(xì)胞的產(chǎn)酶速率及其影響因素，

34、這稱(chēng)為宏觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)或這稱(chēng)為非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)。也可以從細(xì)胞內(nèi)部著眼，研究細(xì)胞中酶合成速率及其影響因素，這謂之微觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)或稱(chēng)為結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，酶的產(chǎn)量高低，是發(fā)酵系統(tǒng)中群體細(xì)胞產(chǎn)酶的集中體現(xiàn)，宏觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)的研究表明，產(chǎn)酶速率與細(xì)胞比生長(zhǎng)速率、細(xì)胞濃度以及細(xì)胞產(chǎn)酶模式有關(guān)一般產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程可表達(dá)為：式中 X細(xì)胞濃度(g /L) 細(xì)胞比生長(zhǎng)速率(h-1) 生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)(IU/g) 非生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率(IU/(gh) E酶濃度(IU/L) t時(shí)間(h)生長(zhǎng)偶聯(lián)型部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型 非生長(zhǎng)偶聯(lián)型 第四節(jié)、固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點(diǎn)；固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條

35、件及其控制；固定化細(xì)胞產(chǎn)酶的應(yīng)用；一、固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點(diǎn)1.提高產(chǎn)酶率 細(xì)胞經(jīng)過(guò)固定化以后，在一定的空間范圍內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，細(xì)胞密度增大，因而使生化反應(yīng)加速，從而提高酶產(chǎn)率。 2.可以反復(fù)使用或連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間固定化細(xì)胞固定在載體上，不容易脫落流失，所以固定化細(xì)胞可以進(jìn)行半連續(xù)發(fā)酵，反復(fù)使用多次。3.基因工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定，不易丟失由于有載體的保護(hù)作用，固定化基因工程菌質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和分裂穩(wěn)定性都顯著提高。4.發(fā)酵穩(wěn)定性好細(xì)胞經(jīng)過(guò)固定化以后，由于受到載體的保護(hù)作用，使細(xì)胞對(duì)溫度、pH值的適應(yīng)范圍增寬；對(duì)蛋白酶和酶抑制劑等的耐受能力增強(qiáng)，所以能夠比較穩(wěn)定的進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。5.縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)

36、備利用率固定化細(xì)胞經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)、生長(zhǎng)好以后，才轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，而且能夠維持一段較長(zhǎng)時(shí)間，因此可以縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率。6.產(chǎn)品容易分離固定化細(xì)胞不溶于水，發(fā)酵完成以后，容易與發(fā)酵液分離，而且發(fā)酵液中所含的游離細(xì)胞很少，有利于產(chǎn)品的分離提純。7.適用于胞外酶等細(xì)胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)二.固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件及控制固定化細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)固定化細(xì)胞制備好以后，一般要進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，以利于固定在載體上的細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖。溶解氧的供給 加大通氣量；改變固定化的載體；改變培養(yǎng)基組分；溫度的控制培養(yǎng)基組分的控制殼聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選及固定化細(xì)胞產(chǎn)酶第五節(jié) 固定化微生物原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶1.定義 固定在載體

37、上，在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的原生質(zhì)體。問(wèn)題：如何制備原生質(zhì)體？一、固定化原生質(zhì)體的特點(diǎn)1、變胞內(nèi)產(chǎn)物為胞外產(chǎn)物 由于解除了細(xì)胞壁的擴(kuò)散障礙，可以使原本存在于細(xì)胞中的胞內(nèi)酶不斷分泌到細(xì)胞外。變革了胞內(nèi)酶的生產(chǎn)工藝。2、提高酶產(chǎn)率由于除去了細(xì)胞壁，增加了細(xì)胞的通透性，有利于氧氣和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和吸收，也有利于胞內(nèi)物質(zhì)的分泌，可以顯著提高產(chǎn)酶率。3、穩(wěn)定性較好固定化原生質(zhì)體由于載體的保護(hù)作用，具有較好的操作穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性，可以反復(fù)使用或者連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間，利于連續(xù)化生產(chǎn)。4、易于分離純化固定化原生質(zhì)體易于和發(fā)酵液分開(kāi)，有利于產(chǎn)物的分離純化，提高產(chǎn)品的質(zhì)量。二、固定化原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶的工

38、藝條件及其控制滲透壓的控制；防治細(xì)胞壁再生；保證原生質(zhì)體的濃度第二章 動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 與微生物細(xì)胞相比，動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培養(yǎng)工藝。 植物、動(dòng)物、微生物細(xì)胞的特性比較細(xì)胞種類(lèi)植物細(xì)胞微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞大小/um20030011010100倍增時(shí)間/h120.3-615營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單復(fù)雜光照要求大多數(shù)要求不要求不要求對(duì)剪切力敏感大多數(shù)不敏感非常敏感主要產(chǎn)物色素、藥物、香精、酶等醇、有機(jī)酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、單克隆抗體、酶等三者之間的差異主要有：植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞的生產(chǎn)周期比微生物長(zhǎng)。植物細(xì)胞和微生物細(xì)

39、胞的營(yíng)養(yǎng)要求較簡(jiǎn)單。植物細(xì)胞的生長(zhǎng)以及次級(jí)代謝物的生產(chǎn)要求一定的光照。植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞對(duì)剪切力敏感。植物、微生物和動(dòng)物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)物各不相同。一、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 過(guò)程1、植物外植體中誘導(dǎo)獲得植物細(xì)胞；2、篩選、誘變、原生質(zhì)體融合或基因重組等手段選育得到優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞；3、人工控制條件的反應(yīng)器中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶；特點(diǎn)1、產(chǎn)率高；2、周期短；3、產(chǎn)品質(zhì)量高；紫杉醇：二萜類(lèi)化合物最早由太平洋紅豆杉Taxus brevifolia的樹(shù)皮中分離廣泛用于治療卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等十幾種癌癥目前主要來(lái)源于紅豆杉屬植物實(shí)例：利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇市場(chǎng)需求抗癌一線用藥銷(xiāo)售額年增長(zhǎng)率5億美元 理論需求量 2g /人, 500萬(wàn)人/年 1000