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1、克隆表達(dá)與引物設(shè)計(jì)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院專題討論Clone,Expression,and Prime Design克隆表達(dá)的路線目的DNA片段和載體的連接目的DNA片段和載體的制備連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化重組子篩選 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白的純化表達(dá)的目的載體的選擇引物的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵什么是克隆？目的基因的克隆及其原核表達(dá)技術(shù)路線RNA ExtractionVectorTVectorTPCR ProductAApET -HEHEHEVRT-PCR轉(zhuǎn)化DE3HE蛋白ITPG誘導(dǎo)大腸桿菌1. 明確實(shí)驗(yàn)的目的，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)引物。2. 選擇表達(dá)載體，根據(jù)載體的酶切位點(diǎn)，在引物的5端加入酶切位點(diǎn)。3. 分析所要擴(kuò)增的基因片

2、段，對(duì)其保守性，抗原優(yōu)勢(shì)位點(diǎn)等進(jìn)行分析。4. 利用軟件，參照引物設(shè)計(jì)的原則，進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c引物設(shè)計(jì)PCR引物設(shè)計(jì)的目的： 找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能夠有效的擴(kuò)增模板DNA。引物設(shè)計(jì)目的和PCR擴(kuò)增引物常用PCR擴(kuò)增的體系（25L）和條件程序：95 變性5min；94 變性30s，52 退火30s，72延伸40s，30 個(gè)循環(huán)；72延伸10min ddH2O17L10buffer2.5LdNTP1L上游引物1L下游引物1L模板2LTaq 酶0.5L3355Sense primerAntisense primer引物設(shè)計(jì)的原則1. 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。2. 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；避開產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。自由能G58.6l kJ/mol。3. 引物長(zhǎng)度一般在1530堿基之間。4. G+C含量在40%60%之間。5. 堿基要隨機(jī)分布。6. 引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)；引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。 7

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