In-Fusion克隆技術介紹2012new課件

1、In-Fusion克隆技術介紹寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司9/23/2022主要內(nèi)容 1In-Fusion技術原理 3In-Fusion應用實例 4In-Fusion應用文獻 2In-Fusion實驗方法9/23/20222In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹In-Fusion技術原理示意圖In-Fusion酶Clontech專利50 ，15 min單管反應9/23/20223In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹In-Fusion技術特點In-Fusion不受載體限制不受酶切位點限制不附加任何冗余序列一次反應單管操作陽性率高達80%9/23/20224In-Fusion克隆技術介

2、紹克隆技術介紹主要內(nèi)容 1In-Fusion技術原理 3In-Fusion應用實例 4In-Fusion應用文獻 2In-Fusion實驗方法9/23/20225In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹In-Fusion引物設計原則同源序列部分是與線性化載體末端5end前15 bp相互補的堿基序列黏性末端無需進行末端補平若保留酶切位點，需補齊酶切位點缺失堿基9/23/20227In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹In-Fusion引物設計-原則1黏性末端（5 懸掛）黏性末端（3懸掛） 平末端9/23/20228In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹In-Fusion引物設計-原則2

3、黏性末端（5 懸掛）黏性末端（3懸掛） 平末端9/23/202210In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹In-Fusion引物設計原則同源序列部分是與線性化載體末端5end前15 bp相互補的堿基序列黏性末端無需進行末端補平若保留酶切位點，需補齊酶切位點缺失堿基9/23/202211In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹In-Fusion引物設計-原則3補齊酶切位點部分缺失堿基9/23/202212In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹載體線性化PCR擴增酶切處理9/23/202214In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹建立In-Fusion連接體系Rxn Componen

4、tCloning Rxn5X In-Fusion HD Enzyme Premix 2 lLinearized Vector x l*Purified PCR Fragment x l*dH2O x lTotal Volume 10 lLinearized vector : Purified PCR fragment(摩爾比)=1:2*10 kb: 50-200 ng*10 kb: 50-200 ng9/23/202215In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹In-Fusion應用多片段克隆插入突變位點構建載體模型高通量克隆9/23/202217In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹I

5、n-Fusion應用實例 In-FusionTM assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Baogong Zhu, Guifang Cai, et al. BioTechniques, Sep 2007; 43:354-3599/23/202218In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹In-Fusion應用實例-多片段連接多片段連接-構建真正無縫融合蛋白 將白細胞介素2 (IL-2)分泌信號序列與CD101胞外域序列（刪除內(nèi)源性信號序列）和鼠

6、免疫球蛋白 G3 (IgG3)的可結晶片段進行融合，構建無縫融合蛋白IL-2 signal-CD101-Fc ，并將其轉染COS細胞檢測表達情況。實驗流程設計引物；擴增目的片段及載體線性化；建立In-Fusion連接反應體系。9/23/202219In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹In-Fusion應用實例-多片段連接引物設計并擴增目的片段IL-2 Signal, CD101和Murine IgG3 IL-2 Signal with Overlaps to NcoI-Digested Vector and CD101, 88-bp PCR ProductSense (NcoI unde

7、rlined)5-TTCAAATCCACCATGGATAGAATGCAATTGTTG-3Antisense5-CTGTTACTTCTCTCTGAGAATTCGTAACCAAAGCCAAAGACAAAGCAATCA-3CD101, 2799-bp PCR ProductSense5-CAGAGAGAAGTAACAGTTCAGAAA-3Antisense5-GGCCGAGGAGCAGATCCTGGAA-3Murine IgG3 with Overlaps to CD101 and SalI-Digested Vector, 771-bp PCR ProductSense5-ATCTGCTCCTCG

8、GCCCCTAGAATACCCAAGCCCAGTACC-3Antisense (SalI underlined)5-AGTAACGTTAGTCGACTCAGTGTCTTGTAAGACCCGAGGA-39/23/202220In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹In-Fusion應用實例-多片段連接建立In-Fusion連接反應體系（ 10 l ）IL-2 Signal CD101 Domain Murine IgG3 Fc Tail Vector Total Transformants Error-Free/ Sequence (No.)88 bp, 1.6 ng 2799 bp, 49.

9、3 ng 771 bp, 13.6 ng 11,365 bp, 100 ng 690 1/2結論：克隆陽性率為50%。轉染COS 細胞后，融合蛋白IL-2 signal- CD101-Fc表達情況良好。9/23/202221In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹In-Fusion應用實例9/23/202222In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹In-Fusion應用實例-定點突變策略一5 Sense Primer (Overlap with Vector Underlined, SpeI Site Bold)5-GCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTG-3Antisense

10、Mutant Primer (Mutation Underlined)206-bp PCR Product5-GAAGCGGATGAGTACAGACAGGGCAAAGTC-3Sense Mutant Primer (Mutation Underlined)5-TGTACTCATCCGCTTCTCACAACAGCAACAGC-33 Antisense Primer (BspEI Site Bold)509-bp PCR product5-TGTGGCTTCCTCCGGAAGGGTGCTTGGGGTTA-3引物設計并擴增目的片段206-bp 和509-bp 將human TIM-4 (hTIM-4

11、)第45位的色氨酸（W或Trp）突變?yōu)楸彼幔ˋ或Ala），構建hTIM-4 W45A 突變體。9/23/202224In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹In-Fusion應用實例-定點突變建立In-Fusion連接反應體系（ 10 l ）6375-bp fragment containing the vector and 3 end of hTIM-4206-bp PCR Product509-bp PCR product24 ng 1.6 ng 3.8 ng 結論：成功構建了5個TIM-4 突變體，經(jīng)過測序驗證，其克隆陽性率 分別 為3/3、3/3、2/3、2/3、1/8。9/23/

12、202225In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹主要內(nèi)容 4In-Fusion應用文獻 3In-Fusion應用實例 1In-Fusion技術原理 2In-Fusion實驗方法9/23/202227In-Fusion克隆技術介紹克隆技術介紹In-Fusion應用文獻Comparative Epigenomic Analysis of Murine and Human Adipogenesis Tarjei S. Mikkelsen, Zhao Xu, et al. Cell, Oct 2010 ; 143 : 156169In-Fusion BioBrick assembly and r

13、e-engineeringSean C. Sleight, Bryan A. Bartley, et al. Nucleic Acids Res., May 2010; 38: 2624 - 2636.Lumen Thiol Oxidoreductase1, a Disulfide Bond-Forming Catalyst, Is Required for the Assembly of Photosystem II in ArabidopsisMohamed Karamoko, Sara Cline, Kevin Redding, et al. PLANT CELL, Dec 2011;

14、23: 4462 - 4475.Ehrlichia chaffeensis TRP120 Interacts with a Diverse Array of Eukaryotic Proteins Involved in Transcription, Signaling, and Cytoskeleton OrganizationTian Luo, Jeeba A. Kuriakose, Bing Zhu, et al. Infect. Immun., Nov 2011; 79: 4382 - 4391.GMechanism of auxiliary -subunit-mediated mem

15、brane targeting of L-type (CaV1.2) channelsKun Fang and Henry M. Colecraft. J. Physiol., Sep 2011; 589: 4437 - 4455.Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus-Encoded Ovarian Tumor Protease Activity Is Dispensable for Virus RNA Polymerase Functionric Bergeron, Csar G. Albario, et al. J. Virol., Jan 2010; 84: 216 - 226.CCS5, a Thioredoxin-like Protein Involved in the Assembly of Plastid c-Type CytochromesStphane T. Gabilly, Beth Welty Dreyfuss, et al. J. Biol. Chem., Sep 2010; 285: 29738 - 29749.Major taste loss in carnivorous mammalsPeihua Jiang, Je