實驗室規(guī)則與安全

1、實驗室規(guī)則與安全余 蔚1微生物危害程度分級食品中可能存在的微生物分類危害程度菌落總數(shù)，大腸菌群和糞大腸菌群I級低個體危害，低群體危害；常見食源性致病菌（沙門，志賀，金葡，單核細(xì)胞增生李氏菌等）II級中等個體危害，有限群體危害肉毒羧菌（發(fā)酵制品，肉制品），炭疽芽孢桿菌（肉類）等III級高個體危害，低群體危害鼠疫耶爾森氏菌（畜肉），埃爾托生物型霍亂弧菌（海產(chǎn)品，各類食品）等IV級高個體，高群體危害2022/9/252實驗室生物安全防護(hù)水平BSL（Biosafety Level）分為：I，II，III，IV級，分別以BSL-1，BSL-2，BSL-3，BSL-4表示實驗室的生物安全防護(hù)水平生物安全實

2、驗室分級2022/9/253生物安全實驗室的選擇II級危害常見致病菌的檢測，生化鑒定，免疫實驗，PCR提取，涂片，顯微觀察等均需在BSL-2實驗室進(jìn)行。2022/9/254實驗室生物安全防護(hù)屏障一級屏障主要包括：各級生物安全柜（用于防護(hù)可能生成的含有病原微生物的氣溶膠）和個人防護(hù)裝備二級屏障主要包括：建筑結(jié)構(gòu)，通風(fēng)空調(diào)，給水排水，電氣和控制系統(tǒng)2022/9/255生物安全實驗室的硬件要求 BSL-2（基礎(chǔ)生物實驗室 ）可共用建筑物，但應(yīng)有可自動關(guān)閉帶鎖的門，實驗室的門應(yīng)有可視窗應(yīng)采用窗戶進(jìn)行自然通風(fēng)，并應(yīng)帶有防蟲紗窗。應(yīng)配備有生物安全柜，生物安全柜的作用是防護(hù)生成的含有病原生物的氣溶膠實驗室門

3、上應(yīng)標(biāo)有國際通用的生物危害警告標(biāo)志?？諝饬飨颍壕彌_區(qū)-低污染區(qū)-嚴(yán)重污染區(qū)，每個區(qū)之間有-10-60pa的壓差，防止空氣倒流2022/9/2562022/9/257生物安全柜（BSCs）分級2022/9/258不同保護(hù)類型及生物安全柜的選擇2022/9/259無菌室的硬件要求墻面及地面應(yīng)光滑，易于清潔與消毒入口處應(yīng)設(shè)有緩沖間，緩沖間應(yīng)有紫外燈消毒，并有自動洗手和干手裝置推薦溫度為20，濕度為40%-60%應(yīng)配備消毒裝置：紫外燈等2022/9/2510微生物實驗室進(jìn)入規(guī)范只有經(jīng)批準(zhǔn)的人員方可進(jìn)入實驗室工作區(qū)域。實驗室的門應(yīng)保持關(guān)閉。兒童以及與實驗無關(guān)的動物不應(yīng)被批準(zhǔn)或允許進(jìn)入實驗室工作區(qū)域。20

4、22/9/2511無菌室的準(zhǔn)備與進(jìn)入無菌室使用前必須打開無菌室的紫外燈輻照滅菌30分鐘以上，并且同時打開超凈臺進(jìn)行吹風(fēng) 。進(jìn)入無菌室前30分鐘應(yīng)關(guān)閉紫外燈，以減少紫外線及臭氧對人體的傷害。進(jìn)入程序：肥皂（消毒液）洗手換無菌室工作鞋進(jìn)入緩沖間更換無菌室工作服，帶口罩，帽子2022/9/2512人員防護(hù)在實驗室工作中，任何時候都必須穿著工作服。在進(jìn)行可能接觸到感染性材料的操作時，必須戴手套，手套使用完畢，應(yīng)先對手套進(jìn)行消毒再摘除手套，隨后必須洗手。在處理完感染性材料或離開實驗室之前，都必須先洗手。嚴(yán)禁穿著實驗室工作服離開實驗室。禁止在實驗室工作區(qū)域進(jìn)食，飲水，化妝，戴隱性眼睛。禁止在實驗室工作區(qū)域

5、儲存食物和飲料。實驗室工作服和日常服裝必須分開放置。2022/9/2513無菌室工作結(jié)束后的處理收拾操作臺面的廢棄物，用容器從傳遞窗傳出。噴75%酒精（消毒液）消毒操作臺面，離開。進(jìn)入緩沖間，脫下工作服，口罩，帽子（一次性口罩，帽子應(yīng)帶出丟棄），換鞋2022/9/2514廢棄物的處理程序?qū)嶒炇覒?yīng)配備有普通廢棄物和污染廢棄物兩個垃圾箱，在污染廢棄物垃圾箱上應(yīng)有生物危害標(biāo)志。廢棄物應(yīng)分類收集：實驗室培養(yǎng)物及其污染物應(yīng)放入污染廢棄物垃圾箱內(nèi)。廢棄物的處理與消毒：121，30分鐘或以上高壓蒸汽滅菌，消毒液滅菌，或者高溫滅菌。任何必要的清洗，修復(fù)必須在滅菌或消毒處理之后進(jìn)行2022/9/2515實驗室的

6、污染清除程序無菌室：紫外燈消毒：30min（室內(nèi)溫度20，濕度40%-60%）；30min（室內(nèi)溫度40,濕度60%）臭氧消毒：20mg/m3濃度的臭氧消毒時間30min消毒驗證：平板計數(shù)瓊脂平板開蓋暴露15min后，轉(zhuǎn)移至36培養(yǎng)48h，計數(shù)，要求15cfu2022/9/2516實驗室的污染清除程序?qū)嶒炇覐U棄物：高壓蒸汽滅菌是清除污染的首選方法。實驗室的培養(yǎng)物，感染材料等應(yīng)先通過高壓蒸汽滅菌（121，30min或以上）處理其他消毒方法：消毒液（70%乙醇，有效氯濃度1g/mL的漂白劑，100mL/L的甲醇等）浸泡，高溫消毒等2022/9/2517實驗室的污染清除程序生物安全柜：多聚甲醛（空氣

7、中濃度達(dá)到0.8%）熏蒸6h，比多聚甲醛濃度高10%的碳酸氫銨蒸發(fā)后，接通生物安全柜電源，啟動2s，使碳酸氫銨循環(huán)2022/9/2518實驗室的污染清除程序手部污染：大部分情況下，用普通的肥皂和水徹底沖洗手部即可清除手部污染，在高度危險的情況下，建議使用殺菌肥皂。手要完全抹上肥皂，搓洗至少10s，用干凈水沖洗后再用干凈毛巾或紙巾擦干。沒有條件徹底洗手或洗手不方便，應(yīng)用70%酒精來清除手部的輕度污染。2022/9/2519安全應(yīng)急程序刺傷，切割傷或擦傷：脫下防護(hù)服，用肥皂和大量流水沖洗受傷部位，應(yīng)盡可能擠出傷口處的血液，70%酒精或其他消毒劑消毒傷口，必要時進(jìn)行醫(yī)學(xué)處理。潛在危害性氣溶膠的釋放（

8、生物安全柜外）：所有人員立即撤離，任何暴露人員都應(yīng)進(jìn)行醫(yī)學(xué)咨詢，在一定時間內(nèi)嚴(yán)禁人員進(jìn)入，應(yīng)在門口張貼“嚴(yán)禁進(jìn)入”的標(biāo)志。過了相應(yīng)的時間后，應(yīng)在生物專家的指導(dǎo)下清除污染才可以正常使用。2022/9/2520安全應(yīng)急程序容器破碎及感染性物質(zhì)溢出：應(yīng)立即用紙巾或者毛巾覆蓋在污染物上，隨后在其上倒消毒劑，作用30min后，清理掉布，紙巾及破碎物品，破碎玻璃應(yīng)用鑷子處理，處理用的紙巾，毛巾及破碎物品應(yīng)放入污染廢棄物垃圾箱中，經(jīng)過消毒處理后再丟棄。所有的操作過程都應(yīng)戴手套處理。2022/9/2521分子生物實驗室硬件要求基因檢測實驗室分隔的工作區(qū)：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，樣品粉碎區(qū)和準(zhǔn)備區(qū)，PCR擴(kuò)增區(qū)，擴(kuò)增

9、產(chǎn)物分析區(qū)。工作區(qū)工作服，試劑，儀器等必須有明確的標(biāo)記，避免混用。各實驗區(qū)域應(yīng)有專用的儀器設(shè)備，同一區(qū)域內(nèi)的儀器設(shè)備、物品和工作服應(yīng)有明顯標(biāo)記，避免與其他區(qū)域的儀器設(shè)備混用。儀器設(shè)備的校準(zhǔn)應(yīng)符合ISO/IEC 17025：1999中5.5的規(guī)定。2022/9/2522PCR產(chǎn)物分析區(qū)本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，應(yīng)采用負(fù)壓條件或減壓（如排風(fēng)扇等）條件以減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散到其他區(qū)域。2022/9/2523基因檢驗實驗室進(jìn)入規(guī)范單一方向進(jìn)入：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)樣品粉碎區(qū)和準(zhǔn)備區(qū)PCR擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。不同區(qū)域使用不同顏色工作服，工作服不得帶出所在工作區(qū)域送檢樣品的包裝應(yīng)完好并有明確的標(biāo)識；

10、在對實驗室樣品進(jìn)行混樣、測試樣品的制備和稱量過程中應(yīng)避免交叉污染2022/9/2524實驗室的污染清除程序?qū)嶒炇铱臻g應(yīng)定期進(jìn)行紫外照射。實驗臺面：10%次氯酸鈉或3%雙氧水清潔臺面實驗后紫外燈照射實驗臺面，照射過夜。實驗室的清潔程序應(yīng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)樣品粉碎區(qū)和準(zhǔn)備區(qū)PCR擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)方向清潔。含PCR產(chǎn)物的任何廢液，或污染了PCR產(chǎn)物的吸頭等試驗用具，應(yīng)浸泡于1mol/L的鹽酸溶液，清除污染后丟棄。2022/9/2525個人防護(hù)在整個實驗操作過程中要穿實驗服，戴手套。紫外線：應(yīng)佩戴具有紫外線防護(hù)功能的護(hù)目鏡和/或防護(hù)面罩，并遮蔽暴露的皮膚。2022/9/2526實驗試劑和危害廢棄物

11、管理具有毒性，放射性，致癌或致突變性的試劑應(yīng)有明顯的標(biāo)志使用過的移液器吸頭應(yīng)放入含有10%次氯酸鈉溶液的容器內(nèi)浸泡，浸泡時間不宜少于24 h。含有PCR產(chǎn)物的所有液體及廢棄物應(yīng)放入含有1 mol/L HCl的容器中浸泡，浸泡時間不宜少于6 h；采用PCR-ELISA方法檢測時洗板機(jī)洗板所產(chǎn)生的廢液應(yīng)收集至1 mol/L HCl溶液中。對含有EB或經(jīng)EB浸泡過的瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液的處理:KMnO4-NaOH（高濃度），活性炭過濾（低濃度）。陽性質(zhì)粒宜放入1 mol/L HCl溶液中浸泡，浸泡時間不宜少于6 h。2022/9/2527微生物檢驗原理2022/9/2528菌落總數(shù)食品檢樣經(jīng)過處理

12、，在一定條件下（培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間，培養(yǎng)基成分等）培養(yǎng)后，所形成的菌落數(shù)。所得到的是嗜中溫，需氧或兼性厭氧菌。單位：CFU（Colony Forming Units）檢驗原理：36平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)2d2022/9/2529大腸菌群大腸菌群，在36培養(yǎng)2d，能產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧的G-無芽孢桿菌MPN最近似值檢測原理：LST肉湯初發(fā)酵，BGLB肉湯驗證2022/9/2530霉菌和酵母在孟加拉紅培養(yǎng)基上，36培養(yǎng)5d，觀察結(jié)果霉菌菌落特征：菌落大、疏松、干燥、不透明，有的呈絨毛狀或絮狀或網(wǎng)狀等，菌體可沿培養(yǎng)基表面蔓延生長，呈現(xiàn)紅、黃、綠、青綠、青灰、黑、白、灰等多種顏色。酵母菌落特征：菌落大而

13、厚，圓形，光滑濕潤，粘性，顏色單調(diào)。常見白色、土黃色、紅色。2022/9/25312022/9/2532沙門氏菌檢驗原理：前增菌：食品中沙門氏菌含量較少，且常由于食品加工過程使其受到損傷而處于瀕死狀態(tài)，所以對某些加工食品必須經(jīng)過前增菌處理，使其恢復(fù)活力，生雞蛋和肉類可省略此步驟選擇性增菌：沙門增殖，其他大多數(shù)細(xì)菌收到抑制。生化鑒定：借助于三糖鐵、靛基質(zhì)、尿素、KCN、賴氨酸等試驗可與腸道其他菌屬相鑒別。血清學(xué)鑒定：通過菌種特殊的抗原結(jié)構(gòu)（O抗原為主），可以把他們分辨出來。步驟：復(fù)活（前增菌）培養(yǎng)（選擇性增菌）分離（平板劃線分離培養(yǎng)）鑒定（生化鑒定/血清鑒定）2022/9/2533金黃色葡萄球菌

14、檢驗原理7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨蛋白肉湯：金葡耐鹽性強(qiáng)適宜生長鹽濃度為5%7.5%，10%15%能生長 血平板：金葡可產(chǎn)生溶血素，血平板上生長菌落周圍有溶血環(huán)。 BP平板，Baird-Parker平板：金葡可產(chǎn)生卵磷脂酶，分解卵磷脂，產(chǎn)生甘油酯和可溶性磷酸膽鹽，所以在BP平板上生長菌落為黑色，周圍有渾濁帶，外層有一透明圈。 金黃色葡萄球菌：黑色菌落，有暈圈和透明環(huán) 表皮葡萄球菌：黑色菌落 奇異變形桿菌：褐色菌落 大腸艾希氏菌：被抑制 血凝固酶試驗：金葡菌可產(chǎn)生血漿凝固酶，可令血漿中的血漿蛋白酶原變成血漿蛋白酶，使血漿凝固，這是鑒定致病性金葡的重要指標(biāo)。步驟：前處理增菌分離鏡檢生化

15、鑒定2022/9/2534志賀氏菌實驗原理樣品在GN增菌液中增菌68h后，HE或SS及麥康凱或EMB選擇性平板進(jìn)行分離，三糖鐵初步生化試驗，半固體培養(yǎng)基動力試驗，如三糖鐵上：斜面陰性，底層陽性，不產(chǎn)氣，硫化氫陰性，無動力，可疑為志賀氏菌。步驟：增菌分離培養(yǎng)生化鑒定血清學(xué)鑒定2022/9/2535分子生物學(xué)方法在微生物檢測中的應(yīng)用PCR方法：有普通PCR，熒光PCR，實時熒光PCR（定量PCR）等多種方法。基因探針法一般也需要增菌，然后加探針試劑雜交，然后在熒光顯微鏡熒光檢測器下獲得結(jié)果。PCR方法一般不需增菌太長時間，通過PCR方法對待測微生物的特征片斷進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過凝膠電泳或熒光PCR技

16、術(shù)判斷結(jié)果。2022/9/2536分子生物學(xué)方法病原菌檢測系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)分子生物學(xué)方法檢測致病菌，特異性較強(qiáng)，技術(shù)較為前沿，特別是相對國標(biāo)方面來說。但國外用戶反映其假陽性概率仍然較高，因此只能作為一種初篩方法。速度方面：仍然需要增菌，一般是第二天出結(jié)果，與免疫法比沒有速度優(yōu)勢目前不少產(chǎn)品已經(jīng)通過AOAC的認(rèn)證。2022/9/2537DNA 探針技術(shù)DNA 探針技術(shù)又稱分子雜交技術(shù), 是利用DNA分子的變性、復(fù)性以及堿基互補(bǔ)配對的高度精確性, 對某一特異性DNA 序列進(jìn)行探查的新技術(shù)。DNA 探針是利用同位素、生物素等標(biāo)記的特定DNA 片斷, 該片斷可大至寄生蟲基因組DNA, 小至20 個堿基。當(dāng)

17、DNA探針與待測的非標(biāo)記單鏈DNA( 或RNA) 按堿基順序互補(bǔ)結(jié)合時, 以氫健將2 條單鏈連接而形成標(biāo)記DNA- DNA( 或標(biāo)記DNA- RNA) 的雙鏈雜交分子。將未配對結(jié)合的核苷酸溶解后用檢測系統(tǒng)( 放射自顯影或酶檢測等) 檢測雜交反應(yīng)結(jié)果。由于DNA 分子堿基互補(bǔ)的精確性, 單鏈DNA 探針僅與樣品中變性處理的DNA 單鏈出現(xiàn)配對雜交, 由此決定了探針的特異性;用放射性同位素( 如32P) 或生物素標(biāo)記探針, 使雜交試驗同時具有高度的敏感性。2022/9/2538多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCRPCR 的基本原理是在體外對特定的雙鏈DNA 片斷進(jìn)行高效擴(kuò)增, 故又稱基因體外擴(kuò)增法。首先將靶DNA

18、 雙鏈加熱變性為單鏈, 然后加入兩段人工合成的與靶DNA 兩端互補(bǔ)的寡核苷酸片斷作為引物, 即左端引物和右端引物。該對引物與互補(bǔ)的DNA 單鏈堿基互補(bǔ)結(jié)合后, 在有DNA 聚合酶和4 種dNTPs 底物存在的情況下, 引物沿模板DNA 鏈按5- 3方向延伸, 自動合成新的DNA 雙鏈。新合成的DNA 雙鏈又可作為擴(kuò)增的模板, 繼續(xù)重復(fù)以上的DNA 多聚酶鏈反應(yīng)。經(jīng)過2535 次循環(huán), 可將靶DNA 序列擴(kuò)增近百萬倍。PCR技術(shù)有快速、特、敏感等特點(diǎn), 因而該技術(shù)在食品微生物檢測中具有很大的應(yīng)用潛力。2022/9/2539基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)是上個世紀(jì)末誕生的一項新型生物技術(shù)。它是將各種基因寡核苷酸點(diǎn)樣于芯片表面,微生物樣品DNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后制備熒光標(biāo)記探針, 然后再與芯片上寡核苷