第一組蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的測定

1、第一組蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的測定第1頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六NMR(nuclear magnetic resonance )核磁共振 第2頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六前言 簡介約15,000 種蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)已被解出，80%是用X-ray 解出，20%用NMR 解出NMR 解出三維結(jié)構(gòu)時不需要長單晶(single crystal)，只要溶在水溶液當(dāng)中即可，比較符合生物巨分子的生理狀態(tài)。第3頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六NMR產(chǎn)生訊號的原理 1. C、N、H、S等atoms的同位素label l 不等於0 始

2、可產(chǎn)生NMR訊號補(bǔ)充每個元素中的核子(nucleus) ，其磁自旋量子數(shù)(magnetic spin quantum number)以I 來代表。若 I 0 ，此核子在磁場中，會產(chǎn)生NMR 訊號若 I = 0，此核子在磁場中，無法產(chǎn)生NMR 訊號。質(zhì)量數(shù)和質(zhì)子數(shù)均為偶數(shù)的原子核，l=0 質(zhì)量數(shù)為奇數(shù)的原子核，l=半整數(shù) 質(zhì)量數(shù)為偶數(shù)，質(zhì)子數(shù)為奇數(shù)的原子核，l=整數(shù) 第4頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六 核磁共振儀的射頻器(transmitter)打了一個脈衝(pulse)，將此淨(jìng)磁化量偏移z 軸，此偏移的磁化量就沿著磁場方向(z 軸)做進(jìn)動(precession)。造

3、成此磁化量形成陀螺的軌跡，如下頁圖所示。此磁化量的軌跡，會引導(dǎo)一個振盪電流而被記錄下來。第5頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六2 .從NMR的peak area 和高度比可知特定原子的數(shù)量和原子鍵結(jié)的環(huán)境。第6頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六NMR的光譜分析一維：H太多 訊號複雜 難以分析第7頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六二維：NOE效應(yīng) 可得知原子間的距離第8頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六三維：NOE效應(yīng)+TOCSY技術(shù)+NOESY技術(shù) 旋性、凡得瓦半徑、鍵角 輸入computer ru

4、n出可能的三度結(jié)構(gòu)第9頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六補(bǔ)充NOE 效應(yīng) (Nuclear Overhouser Effect) NMR 之所以能解出蛋白質(zhì)分子在水溶液的三維結(jié)構(gòu)，主要的就是要靠NOE 效應(yīng)。NOE(I I0) / I0I 為質(zhì)子對被照射時的intensityI0 為質(zhì)子對未被照射時的intensity如果NOE愈強(qiáng)，表示二質(zhì)子間距離愈短。NOE 的大小與質(zhì)子對之間距()的6 次方成反比：NOE 1 / 6第10頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六NMR的研究領(lǐng)域 一、蛋白質(zhì)與分子之結(jié)合 (Interaction) 利用核磁共振技術(shù)

5、我們可輕易地藉由測量化學(xué)位移擾動(chemicalshift perturbation)的方式找出protein與ligand 作用的殘基，亦可進(jìn)一步解出整個complex 的結(jié)構(gòu)。化學(xué)位移的擾動主要是因?yàn)閜rotein與ligand 結(jié)合後某些殘基會和ligand 接觸或作用，而使得化學(xué)環(huán)境改變，藉由測量各個殘基化學(xué)位移的變化情形，便能找出ligand 的結(jié)合位置(活性位置)。第11頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六 二、蛋白質(zhì)分子之折疊 (Protein Folding)自然界中所存在的折疊構(gòu)形約只有1,000- 5,000 種。 且有許多蛋白質(zhì)屬於同一個famil

6、y，具有高 度的sequence homology。定出這1,000-5,000 種蛋白質(zhì)的折疊構(gòu)形並 研究這些構(gòu)形所具有的生化活性，便能提供 其他屬於同family 的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)與功能上 的資訊。第12頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六優(yōu)缺比較 X-ray 繞射技術(shù)快速且較不受分子量的限制但是並不是每一種蛋白質(zhì)都能得到良好的結(jié)晶，(蛋白質(zhì)結(jié)晶的取得仍是現(xiàn)今結(jié)晶技術(shù)的一大挑戰(zhàn))核磁共振找尋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)較耗費(fèi)人力及時間圖譜分析的工作是既複雜又費(fèi)時第13頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六X-Ray Crystallography第14頁，共30頁，2

7、022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六原理:所謂 X-Ray繞射結(jié)晶法即是利用X-Ray射向蛋白質(zhì)晶體使X-ray 產(chǎn)生繞射，經(jīng)由繞射使照相底片曝光而產(chǎn)生一投影圖形，再將此繞射圖案作分析，作出電子密度圖，經(jīng)過一連串的計(jì)算之後，即可判定出蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)! Why要使用X-Ray ? 我們採用X 光來決定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，最大的理由，即是因?yàn)閄 光的波長10-12-10-8m 恰好近似於蛋白質(zhì)晶體的晶格大小，因而可以產(chǎn)生繞射，且由於X 光無法聚焦，因此我們必須使用底片曝光法來分析繞射所得的結(jié)果。第15頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六X 光依形成的方式不同，分成兩種： (

8、1)White radiation: 以經(jīng)高壓加速之電子撞擊陽極靶標(biāo)，高速電子受到靶標(biāo)原子的阻擋，急遽停止下來，其部分動能即以X 光的形式釋出來。以急遽停止電子所產(chǎn)生之X 光與原子之特性無關(guān)，而是以連續(xù)性不同波長同時出現(xiàn)，其中最短波長取決於撞擊電子的最高能量。如此產(chǎn)生的光譜，亦稱為白光光譜或連續(xù)光譜(Continuous X-ray spectrum)。 (2)Monochromatic radiation: 高速電子在撞到原子時，很容易將能量傳遞給原子中的電子，而使原子離子化。當(dāng)原子內(nèi)層軌域之電子被激發(fā)後，其空出之位置很快會被外層電子的躍入填滿，在此電子躍遷過程中，由於不同軌域間的能階差，X

9、 光會隨著放出；此種過程所產(chǎn)生的X 光與原子中電子軌域之能階有關(guān)，因此其波長與原子種類有關(guān)，稱之為特性輻射，所形成之光譜則稱為特性光譜(characteristic spectrum)。第16頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六蛋白質(zhì)結(jié)晶製備!X 光繞射結(jié)晶法當(dāng)中很重要的一個條件就是sample 的製備，若是不可結(jié)晶，則鐵定不能進(jìn)行X 光繞射。蛋白質(zhì)要結(jié)晶，首先必須要先大量製備我們所要結(jié)晶的蛋白質(zhì)，因此會裡用載體將記載蛋白質(zhì)序列的核酸輸入到生產(chǎn)蛋白質(zhì)的菌體中，如此便可大量製造出純度高的蛋白質(zhì)，而後氣相擴(kuò)散法將此蛋白質(zhì)結(jié)晶出來。結(jié)晶方式:用氣相擴(kuò)散法結(jié)晶(Vapor Dif

10、fusion Method)，也就是將含有高濃度的蛋白質(zhì)溶液加入適當(dāng)?shù)娜軇?，慢慢降低蛋白質(zhì)的溶解度，使其接近自發(fā)性的沉澱狀態(tài)時，蛋白質(zhì)分子將在整齊的堆疊下形成晶體。第17頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六NMR 與 X-Ray的比較X-ray 的缺點(diǎn)主要是結(jié)晶難結(jié)，也並非所有蛋白質(zhì)都容易結(jié)晶。一旦結(jié)晶了，又要擔(dān)心他跟平時會否有異，譬如某些水溶性的蛋白質(zhì)，原本水分子能協(xié)助固定有功能的構(gòu)型，將其結(jié)晶後，離開了水的環(huán)境，失去固定而變成另一種沒有功能的構(gòu)型。相對的，NMR 的原理不同，並不需要整齊的晶體排列，而是看原子核的磁力矩。NMR 不需要結(jié)晶，也就避開了許多X-ray 繞

11、射的缺點(diǎn)；NMR 可以看到生物分子在正常生理狀態(tài)下的構(gòu)型，可以觀察到連續(xù)的動態(tài)結(jié)構(gòu)，比較不會受到水分子的干擾。有一點(diǎn)值得注意的是，NMR 用低能量的無線電波，而X-ray 繞射要用高能量的X-ray，能量差距相當(dāng)?shù)拇?。雖然NMR 看似比X-ray 繞射有更多的好處，但NMR 有一個嚴(yán)重的缺點(diǎn)：只能觀察20000 原子量以內(nèi)的分子。因?yàn)镹MR 是觀察一個一個的原子，X-ray 繞射則是觀察一個一個的晶格；NMR 的視野被侷限在原子大小，但是X-ray 可大可小，他能觀察金屬原子的晶體，也能觀察生物巨分子的晶體。我們不能直接判斷NMR 跟X-ray 繞射孰優(yōu)孰劣，兩者是互補(bǔ)的關(guān)係。第18頁，共30

12、頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六水的影響蛋白質(zhì)結(jié)晶中常含4060%的水，其液態(tài)的成分會使晶體易碎，且容易使蛋白質(zhì)分子在排列上有不規(guī)則的情形出現(xiàn)，造成繞射數(shù)據(jù)的混亂。但是，若是完全除水的晶體，蛋白質(zhì)的狀態(tài)又與自然環(huán)境下不同，因此水是個很令人頭痛的問題。第19頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六Circular Dichrosim(CD)圓二色光譜第20頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六PolarizerE vectors平面偏振光振動方向保持不變振幅發(fā)生周期性變化平面偏振光第21頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期

13、六兩束相互垂直而相位相差1/4的波長的平面偏振光可以加和成一束圓偏振光平面偏振光疊加成圓偏振光第22頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六振幅保持不變，而方向周期變化，電場向量繞傳播方向螺旋前進(jìn)圓偏振光(circular polarized light)第23頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六朝光源看，電場向量方向按順時針方向旋轉(zhuǎn)的，稱為右圓偏振光；電場向量方向按逆時針方向旋轉(zhuǎn)的，稱為左圓偏振光。第24頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六圓二色性(circular dichrosim)光學(xué)活性分子對左、右圓偏振光的吸收也不同，使

14、左、右圓偏振光透過後變成橢圓偏振光，這種現(xiàn)象稱為圓二色性。第25頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六CD的操作方法左圓、右圓的平面偏振光照射有光學(xué)異構(gòu)的分子，會造成不一樣的吸光度。而不同的結(jié)構(gòu)有獨(dú)特的測出來的吸收圖形，因此可以經(jīng)由比對得知立體結(jié)構(gòu)第26頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六CD對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的研究方法:將待測蛋白質(zhì)溶於適當(dāng)溶劑中，用特定波長的UV測其吸收度，與已知的二級結(jié)構(gòu)的吸收度圖比對，即可查出未知之結(jié)構(gòu)建立資料庫:選取基本的二級結(jié)構(gòu)，將各波長不同的CD吸收值代入程式可得蛋白質(zhì)中各種二級結(jié)構(gòu)之百分比 第27頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期六第28頁，共30頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)59分，星期