T-載體連接方案

1、T-載體連接全過程第一步：PCR擴(kuò)增目的基因及純化PCR反應(yīng)體系：10 x擴(kuò)增緩沖液5.0ulTOC o 1-5 h z10mMdNTP1.0ul引物11.0ul引物21.0ul模板DNA1.0ulTaqDNA聚合1.0ul加雙蒸水至50ul（相同的引物體系可配置PCRMIX體系）PCR反應(yīng)條件：PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。955min95-、45s4060；50s循環(huán)35次72-55s72-10minPCR期間配置瓊脂糖凝膠：PCR結(jié)束以后跑膠驗(yàn)證，并照相，標(biāo)記保存。PCR產(chǎn)物回收（1）單一PCR產(chǎn)物用氯仿法把PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管，加500ul無菌水，500ul氯仿異

2、戊醇（24:1），混勻后10000rpm離心5-10分鐘轉(zhuǎn)移上清（約400ul）至滅菌的新1.5mL的Eppendorf管，加入2倍體積（780叱體積即可）的無水乙醇與40ul3MNaAc。置冰上或-80冰箱30分鐘以上。10000rpm離心10min。棄上清，沉淀用適量的70%的乙醇洗一次，于紙上扣干。小心不要將沉淀洗掉。置于恒溫器上干燥（55）至無色透明或無乙醇?xì)馕?，大至?10min。加入40叱無菌水溶解沉淀備用。（2）多條帶PCR產(chǎn)物用切膠回收試劑盒。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳（大容量上樣系統(tǒng)）切膠并回收目的條帶至1.5ml的離心管，稱重。參照試劑盒說明書進(jìn)行操作（附錄3）。用50ul無

3、菌水洗脫離心柱2次備用。第二步：T-載體連接和轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備工作：制備感受態(tài)細(xì)胞，方法見附錄一，LB培養(yǎng)基，Amp母液，氯化鈣的配制，方法見附錄二；.在微量離心管（PCR管）中配制以下體系：注：T-載體試劑盒開封前要向pMD18-TVector管中加入25ul無菌水，同時(shí)再管上面做標(biāo)記。pMD18-TVector1.0ul外源DNA1.5ulSolutionI2.5ul.16或4低溫連接1h-2h（最好過夜）；.連接產(chǎn)物全量加入50ul的DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕搖勻后冰上放置30min；DH5a感受態(tài)細(xì)胞加5ul0.1M的無菌氯化鈣做陰性對(duì)照；.熱擊：42水浴中熱擊90秒（注：精確計(jì)算時(shí)間，過長(zhǎng)將

4、對(duì)細(xì)胞造成傷害）,熱擊后立即置于冰上冷2-5分鐘（禁止搖動(dòng)）。.復(fù)蘇：向每管中加入預(yù)冷的400ulSOC液體培養(yǎng)基（注：不含Amp）,混勻后37輕搖培養(yǎng)11.5小時(shí),使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（Ampr）。.涂布平板篩選轉(zhuǎn)化質(zhì)粒：將上述各管培養(yǎng)液搖勻后取50ul分別涂布于含Amp的篩選LB平板上。（注：1.將培養(yǎng)液搖勻后涂布，并要把平板涂干。）正面向上放置15分鐘,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37培養(yǎng)過夜。.次日（12-14小時(shí)后）觀察和從平板上挑取單克隆于甘油lb中（10-20%甘油），每個(gè)平板挑3個(gè)單克隆，-20保存。第三步：裂堿法提質(zhì)粒.取40AL的甘

5、油菌接種至于含有0.6mL含有Amp的LB的1.5mLEppendorf管，37震蕩培養(yǎng)過夜；.次日將培養(yǎng)的菌液10000卬山離心3山皿，棄上清。3、加入100AL溶液I振蕩使菌體沉淀充分懸浮，務(wù)必懸浮充分。4、加入200瓦溶液H,立即輕輕翻轉(zhuǎn)幾下，使菌體裂解。可觀察到原渾濁的菌懸浮液變清變粘，放置時(shí)間不能超過6min。5、加入150瓦預(yù)冷的溶液田，立即上下顛倒充分混勻7-10次，不宜太劇烈?？捎^察到白色片狀沉淀出現(xiàn)。6、置冰浴10min,也可置于一20中5min。7、10000rpm離心810min。8、在離心過程中可取未滅菌的新1.5mL的Eppendorf管，加入等體積（350400AL

6、即可）酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）備用，取滅菌的新1.5mL的Eppendorf管，加入2倍體積（780AL體積即可）的無水乙醇與40ul3MNaAc備用。9、離心完將上清迅速倒入已加的酚-氯仿-異戊醇中，充分混勻。小心不要將白色沉淀物倒入酚-氯仿-異戊醇中。10、10000rpm離心10min。11、吸水相，加入已加好的無水乙醇中，顛倒混勻幾次（小心不要吸入酚相，沒把握時(shí)寧可放棄一些水相）。置冰上或-80冰箱30分鐘以上。12、10000rpm離心10min。13、迅速棄上清，沉淀用適量的70%的乙醇洗一次，于紙上扣干。小心不要將沉淀洗掉。14、置于恒溫器上干燥（55）至無色透明或無乙

7、醇?xì)馕?，大至?10min。15、加入40ALTE溶解沉淀，瓊脂糖電泳檢測(cè)。16.20儲(chǔ)存?zhèn)溆谩５谒牟剑篜CR驗(yàn)證PCR反應(yīng)體系：10 x擴(kuò)增緩沖液1.0ul10mMdNTP0.2ulTOC o 1-5 h z通用引物10.2ul通用引物20.2ul模板DNA0.2ulTaqDNA聚合0.2ul加雙蒸水至10ul（最好配置PCRMix）PCR反應(yīng)條件：PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。955min95-、45s55a50s循環(huán)35次72_.：55s7210minPCR期間配置瓊脂糖凝膠，PCR結(jié)束后跑膠驗(yàn)證;記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。注：感受態(tài)制備和試劑配制見附錄附錄一感受態(tài)細(xì)胞的制備（CaCl2法）

8、第一天1、挑DH5a或忖109單克隆菌落至3ml無抗生素的LB中，37搖床培養(yǎng)過夜2、檢查準(zhǔn)備無菌的試劑：0.1MCaCl（應(yīng)提前預(yù)冷）、含10%甘油的0.1MCaCl、無抗生素的LB（500山1三角瓶放置250mlLB）3、檢查準(zhǔn)備無菌的試劑：1.5山1離心管（每250ml培養(yǎng)體系準(zhǔn)備2罐約300個(gè)）、50ml離心管（6-12個(gè)）、200ul與1ml槍尖（各1盒）。第二天1、1:20-50擴(kuò)大培養(yǎng)至250ml培養(yǎng)體系至OD600為0.6-0.8（約3小時(shí)）2、將菌液移入冰水物后開超凈臺(tái)紫外離心機(jī)預(yù)冷，30分鐘后分裝至0ml離心管中，然后于4下50001離心5分鐘；3、棄去上清（輕輕傾倒掉上清

9、液）；加5?J0m預(yù)冷的1mol/I的CaCl溶液，輕輕撥動(dòng)管底使細(xì)胞完全懸浮冰上放置15分鐘后,4下5000rpm離心5分鐘（合并至2管）4、棄去上清（輕輕傾倒掉上清液）；加入.0山1預(yù)冷的1mol/L的CaCl2溶液，輕輕撥動(dòng)管底使細(xì)胞完全懸浮，4下5000卬山離心5分鐘；5、棄去上清，加入15ml預(yù)冷含10%甘油的0.1MCaCl，輕輕懸浮細(xì)胞，將感受態(tài)細(xì)胞懸液分裝成若干份，每份0口l（注意懸液密度要均勻）。6、用液氮速凍，將感受態(tài)細(xì)胞置于-80保存。注：CaCl2處理后的細(xì)胞比較脆弱，盡量溫柔操作!全過程要再冰上操作，及無菌操作！附錄二1.培養(yǎng)基或試劑的配制：（1）LB培養(yǎng)液配方：（單

10、位g/L）胰蛋白胨10酵母提取物5NaCl10按配方稱量藥品,加入一定量的ddH2O后，待完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。分裝至500ml三角瓶（250山1每瓶）或500ml鹽水瓶（500ml每瓶）；121濕熱高壓滅菌20-30分鐘待用。（2）AmpLB培養(yǎng)平皿配方：（單位g/L）胰蛋白胨10酵母提取物5NaCl10按配方稱量藥品,加入一定量的ddH2O后，待完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。分裝后若為固體，另加瓊脂（1.5%）15g（注：LB培養(yǎng)液不加瓊脂）；121濕熱高壓滅菌20-30分鐘，待冷卻至60左右,在超

11、靜工作臺(tái)中加入一定量的Amp儲(chǔ)存液使終濃度為100口g/ml,搖勻后用培養(yǎng)皿鋪板（90山山平皿約鋪10ml）。2、Amp母液：稱取氨芐青霉素50mg溶于1mlddHO中，用0.22Hm微孔濾器過濾除菌，儲(chǔ)存于2-20冰箱.3、0.1mol/LCaCl2溶液:稱0.56gCaCl2無水分析純），溶于50ml重蒸水中，定容至100ml,用0.22口m濾器過濾除菌or高壓滅菌。4、含甘油的0.1mol/LCaCl2溶液：稱0.56gCaCl2（無水分析純），溶于50ml重蒸水中，力口15ml80%的甘油，定容至100ml,用0.22口m濾器過濾除菌or高壓滅菌。附錄三1）在紫外燈下切分含人的瓊脂糖塊，盡可能除去多余的瓊脂糖.放入1.5山1離心管中。2）按每100mg瓊脂糖加入300600口1溶膠液的比例加入溶膠液（本實(shí)驗(yàn)加500過），置55水浴10分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化，期間每2分鐘顛例混勻一次促溶。3）將溶化后的瓊脂糖液移入吸附柱，12000rpm室溫離心1分鐘，倒掉收集管中的液體再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。4）在吸附杜中加入500”漂洗液，室溫靜置1分鐘后，12000rpm室溫離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。5）再在吸附柱中加入