酶免疫技術(shù)3課件

1、酶免疫技術(shù)第一節(jié) 酶免疫技術(shù)的特點(diǎn) 基本原理：Ab+E Ab-E+Ag AgAb-E+底物 顯色 Ag+E Ag-E+Ab AgAb-E+底物 顯色 該實(shí)驗(yàn)利用了酶催化底物的生物放大作用，可對(duì)標(biāo)本中抗原（抗體）進(jìn)行定性、定位和定量分析。相結(jié)合的技術(shù)酶標(biāo)記免疫技術(shù)又稱酶免疫技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)的特異性 酶促反應(yīng)的專一性辣根過(guò)氧化物酶 （HRP） 從辣根菜中提取的，糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基），主酶與酶活性無(wú)關(guān)， 輔基是酶的活性中心。優(yōu)點(diǎn)：分子量小，標(biāo)記物易透入細(xì)胞；標(biāo)記方法簡(jiǎn)單；溶解性好； 價(jià)格低且有商品供應(yīng)；底物種類多。 由于有以上優(yōu)點(diǎn)，因此，是ELISA最常用的酶 。常用酶酶和酶作用底物H

2、RP的底物 DH2+H2O2 D+2H2O HRPDH2為供氫體習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種 酶和酶作用底物HRP催化的反應(yīng)式H2O2為受氫體，HRP對(duì)受氫體的專一性很高。 常用的是過(guò)氧化氫（H2O2)和過(guò)氧化氫尿素（CH6N2O3) ，過(guò)氧化氫很不穩(wěn)定需用前臨時(shí)配制。過(guò)氧化氫尿素配制成應(yīng)用液可長(zhǎng)期保存。 HRP的常見(jiàn)底物 鄰苯二胺 OPD四甲基聯(lián)苯胺 TMB5-氨基水楊酸5-ASA 2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽 ABTS常用底物酶和酶作用底物TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色 ，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測(cè)定波長(zhǎng)450nm ，穩(wěn)定，無(wú)致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。 HRP的常見(jiàn)

3、底物 酶和酶作用底物ELISA試劑盒有兩種液態(tài)試劑A（過(guò)氧化氫），B（TMB），如出現(xiàn)顏色改變應(yīng)廢棄。 固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物迅速分離的最常用方法 固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合到固相載體的表面 三、固相載體第二節(jié)酶免疫技術(shù)分類 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（常用）斑點(diǎn)ELISA斑點(diǎn)酶免疫滲濾實(shí)驗(yàn) 免疫印跡法高靈敏度ELISABAS- ELISA派生出酶免疫技術(shù)的分類酶免疫組織化學(xué)技術(shù)酶免疫測(cè)定技術(shù)均相測(cè)定技術(shù)異相測(cè)定技術(shù)液相法固相法夾心法捕獲法競(jìng)爭(zhēng)性ELISA非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA間接法酶放大免疫測(cè)定技術(shù)克隆酶供體免疫分析平衡法；非平衡法第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzym

4、e linked immunosorbent assay,ELISA) 底物顯色定性或定量的分析原理包被反應(yīng)加入待測(cè)抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234一、基本原理固相的抗原或抗體 酶標(biāo)記物（酶結(jié)合物） 酶反應(yīng)的底物 三個(gè)必要試劑 二、方法類型及反應(yīng)原理1、雙抗體夾心法應(yīng)用： 二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測(cè)定，如 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等。ELISA檢測(cè)抗原的方法4、加酶底物1、包被： 包被已知抗體洗滌 去除未結(jié)合抗體2、加樣：加待測(cè)標(biāo)本 （待測(cè)抗原）3、加酶標(biāo)志物：酶標(biāo)抗體洗滌去除 未結(jié)合物洗滌去除 未結(jié)合物，酶標(biāo)抗體加終止液 5、結(jié)

5、果判定：肉眼觀察定性分 析；酶標(biāo)儀檢測(cè)定性或定量分析 雙位點(diǎn)一步法？1、已知抗體包3、加酶標(biāo)抗體4、加酶作用的底物2、加待檢物4、加酶作用的底物洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測(cè)抗原1、已知抗體包2、加待檢物無(wú)抗3、加酶標(biāo)抗體+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY2、競(jìng)爭(zhēng)法 方法：用已知抗體包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競(jìng)爭(zhēng)與包被物結(jié)合。加底物顯色。 應(yīng)用：用于只有一個(gè)抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）ELISA檢測(cè)抗原的方法1、間接法方法 用已知抗原包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點(diǎn)

6、 一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體應(yīng)用 常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測(cè)定ELISA檢測(cè)抗體的方法2、雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似 應(yīng)用：乙型肝炎表面抗體ELISA檢測(cè)抗體的方法夾心法：有雙抗原夾心法和雙抗體夾心法，兩者步驟相同，操作原理相同。但酶標(biāo)志物和檢測(cè)對(duì)象不同。雙抗原夾心法測(cè)抗體，雙抗體夾心法測(cè)抗原。3、競(jìng)爭(zhēng)法原理：類似檢測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)法 應(yīng)用：乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測(cè) ELISA檢測(cè)抗體的方法捕獲法 應(yīng)用： 病原體急性感染診斷中的IgM型抗體 甲型肝炎HAV-IgM抗體 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體ELISA檢測(cè)抗體的方法洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY 1、固相化抗人IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人IgM2、加待測(cè)物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合