流式細(xì)胞儀的原理與應(yīng)用課件

1、流式細(xì)胞術(shù)原理和應(yīng)用白小燕一 簡(jiǎn)介二 構(gòu)造及工作原理三 FCM的數(shù)據(jù)分析 FCM的應(yīng)用 實(shí)例一 簡(jiǎn) 介 流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer):是集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)以及單克隆抗體技術(shù)為一體的高科技細(xì)胞分析儀。 流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM):利用流式細(xì)胞儀對(duì)處于快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析和分選的技術(shù)。舉例：細(xì)胞周期分布檢測(cè)流路 (液流系統(tǒng)）流動(dòng)室 鞘液SHEATH 樣本流SAMPLE 單細(xì)胞懸液5*1051*106個(gè)/ml光路（光學(xué)系統(tǒng)）光源濾片電路（檢測(cè)系統(tǒng)）光電倍增管PMT放大電路

2、HV及GAIN 增益A/D轉(zhuǎn)換統(tǒng)計(jì) （分析系統(tǒng)） 計(jì)算機(jī)二 構(gòu)造及工作原理 流動(dòng)室是儀器核心部件，被測(cè)樣品在此與激光相交。流動(dòng)室由石英玻璃鋼制成，并在石英玻璃中央開(kāi)一個(gè)孔徑為430m180m的長(zhǎng)方形孔，供細(xì)胞單個(gè)流過(guò)，檢測(cè)區(qū)在該孔的中心，這種流動(dòng)室的光學(xué)特性良好，流速較慢，因而細(xì)胞受照時(shí)間長(zhǎng)，可收集的細(xì)胞信號(hào)光通量大，配上廣角收集透鏡，可獲得很高的檢測(cè)靈敏度和測(cè)量精度。液流系統(tǒng)流動(dòng)室Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid液流系統(tǒng)信 號(hào)散射光信號(hào) FS 細(xì)胞大小 SS 細(xì)胞顆粒性熒光信號(hào) FL1 FITC FL2

3、PE FL3 ECD FL4 PC5光學(xué)系統(tǒng)光路 （濾片特性）光學(xué)系統(tǒng)電路 電壓調(diào)節(jié)光電倍增管電壓 volts增益 Gain信號(hào)放大方式檢測(cè)系統(tǒng)電信號(hào)輸入到放大器放大，放大器分兩類(lèi)：線性放大和對(duì)數(shù)放大。細(xì)胞DNA含量、RNA含量等的測(cè)量一般選用線性放大測(cè)量。 在細(xì)胞膜表面抗原等的檢測(cè)時(shí)，細(xì)胞膜表面抗原的分布有時(shí)要相差幾十倍，甚至幾萬(wàn)倍，通常使用對(duì)數(shù)放大器。 檢測(cè)系統(tǒng)常用熒光染料介紹FITC： 綠色 525nmPE： 橙黃色 575nmECD： 橙紅色 610nmPECY5： 深紅色 675nmPerCP： 深紅色 675nmPECY7： 深紅色 755nm7AAD： 深紅色 675nmPI(碘

4、化丙啶）： 橙紅色 620nm488nm波長(zhǎng)的氬離子激光激發(fā)光路補(bǔ)償FITC/PE/ECD/PC5三 FCM的數(shù)據(jù)分析 單參數(shù)一維直方圖 縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)，橫坐標(biāo)表示相對(duì)熒光信號(hào)或散色光信號(hào)值，單位是道數(shù)。3. 等高線圖 4. 密度圖白血病免疫分型HLA-B27: 強(qiáng)直性脊柱炎淋巴細(xì)胞亞群造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)：造血干細(xì)胞移植網(wǎng)織紅細(xì)胞PNH診斷（CD55、CD59）血小板活化試驗(yàn)1 流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用四 FCM的應(yīng)用 熒光信號(hào)的定量可以用 平均熒光強(qiáng)度（mean值），熒光信號(hào)面積（Area，A）來(lái)表示。1） 蛋白表達(dá)的檢測(cè)2）DNA AnalysisPIEthidium BromideAcridi

5、ne OrangeDAPI (UV excitable)Hoechst 33342 (viable, UV excitable)不能主動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞，需要固定打孔488nm激發(fā)為脂溶性，主動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞UV激發(fā)常用的DNA 染料0 200 400 600 8001000PI Fluorescence2N4NDNA Analysis3） Apoptosis 檢測(cè)A） DNA片斷化檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50300kbp長(zhǎng)的DNA大片段, 或180200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段 C） Annexin V Assay磷脂酰絲氨酸（Ph

6、osphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中 , Annexin-V是一種分子量為3536KD的Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合 Annexin V Assay能夠區(qū)分死亡與凋亡D） TUNEL 細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類(lèi)方法稱(chēng)為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase med