清熱祛濕益氣法對Con A誘導急性肝損傷小鼠的超微病理研究

1、清熱祛濕益氣法對Con A誘導急性肝損傷小鼠的超微病理研究【摘要】目的觀察清熱祛濕益氣法(QSYF)對nA誘導肝損傷小鼠肝組織超微構造的影響。方法Balb/雄性小鼠隨機分為空白對照組，模型對照組，QSYF低、中、高劑量組，予雙蒸水(空白對照組、模型對照組)或QSYF藥劑(QSYF不同劑量組)，連續(xù)灌胃7d，空白對照組注射等量無菌PBS溶液，其他組靜脈注射nA復制肝損傷模型，6h后立即解剖肝臟，同部位取肝組織，進展電鏡觀察。結果模型對照組肝細胞出現(xiàn)許多細小脂滴,內質網(wǎng)、線粒體數(shù)目明顯減少，線粒體腫脹，嵴模糊。核外表發(fā)芽現(xiàn)象并異染色質電子密度增高。QSYF各組均無核外表發(fā)芽等現(xiàn)象，且隨QSYF藥液

2、劑量增大上述病變明顯減輕。結論QSYF對nA誘導的肝損傷具有明顯的拮抗作用?！娟P鍵詞】清熱祛濕益氣法;刀豆蛋白A;肝損傷;超微病理;小鼠清熱祛濕益氣法是中醫(yī)臨床治療肝病的有效治那么，多年來治療乙肝、甲肝等肝臟疾病療效顯著。肝病的發(fā)病機制與T細胞功能紊亂親密相關1，而刀豆蛋白A(nA)可誘導小鼠發(fā)生T細胞依賴性急性肝損傷2，我們進展了清熱祛濕益氣法對該模型動物超微病理實驗研究，以討論清熱祛濕益氣法的作用機理?，F(xiàn)報道如下。1材料1.1試劑刀豆蛋白A(nA)，美國Siga公司產品，批號2022。實驗時用無菌PBS溶液配成2g/l的溶液備用;戊二醛，上海國云集團化學試劑消費，批號20220420。1.

3、2受試藥物清熱祛濕益氣法(簡稱QSYF)中藥由虎杖、連翹、板藍根、黃芪、西洋參、山藥、五味子、甘草組成，經(jīng)提取濃縮為藥物浸膏液，每毫升含原生藥2g，河南省中醫(yī)藥研究院中藥分析室提供，批號20220506。2方法動物隨機分為5組。空白對照組和模型對照組分別給予雙蒸水0.4l/20g，QSYF低、中、高劑量組分別給予QSYF藥液5，10，15g/kg，各組連續(xù)灌胃7d。第7天動物禁食14h后，除空白對照組外，各組小鼠尾靜脈注射nA溶液20g/kg，空白對照組小鼠注射等體積無菌PBS溶液，于注射后6h處死小鼠，立即解剖肝臟，同部位剪取肝組織，做以下處理：將肝組織在蠟板上迅速切成0.53的肝組織小塊，

4、放入預冷的4%戊二醛PBS溶液中固定，鋨酸后固定，常規(guī)制作超薄切片，進展透射電子顯微鏡觀察。3結果3.1QSYF對肝細胞超微構造的影響空白對照組肝細胞形態(tài)正常，核呈卵圓形，細胞質內線粒體豐富，線粒體嵴排列整齊，含有豐富的粗面內質網(wǎng)，粗面內質網(wǎng)未見脫顆粒現(xiàn)象，胞質內未出現(xiàn)異常的形態(tài)構造。見圖1(a，b)。模型組肝細胞形態(tài)多邊形，肝細胞漿內出現(xiàn)許多細小脂滴;線粒體腫脹，數(shù)目明顯減少，線粒體嵴變短或模糊消失，嵴內腔增大呈泡狀;內質網(wǎng)也明顯減少并呈泡狀構造。細胞核可見出芽狀態(tài)，異染色質電子密度增高，核仁電子密度也增高。見圖1(，d)。SYF低、中、高劑量組與模型組比擬，隨劑量增大肝細胞質內脂滴減少，線

5、粒體、內質網(wǎng)增多，中、高劑量組肝細胞內線粒體嵴大局部排列整齊，細胞核異染色質明顯減少，而常染色質明顯增多;高劑量肝細胞內質網(wǎng)明顯增多并呈多層狀排列。各劑量組均未有細胞核出芽現(xiàn)象。見圖1(e,f,g,h,i,j)。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.圖1各組小鼠肝組織超微構造病理圖片比擬3.2QSYF各組肝細胞立體計量學定量觀測結果每組動物隨機取兩只動物肝組織，各肝組織隨機切3張切片。每張切片隨機拍5張照片，共計30張/組，進展立體計量學測定肝細胞線粒體的體密度(Vv)、比外表()、比膜面()和內質網(wǎng)比膜面及核染質常異染色質的體密度(Vv)、核比外表測量。結果顯示，模型組與空白組比擬線粒體Vv、線粒體、線粒體

6、、內質網(wǎng)、核比外表測量值均顯著降低，QSYF中、高劑量組與模型組比擬上述指標均明顯升高，差異均有顯著性意義(P0.05)。見表12。表1各組肝細胞線粒體體密度、比外表、比膜面及內質網(wǎng)比膜面測得結果表2各組肝細胞細胞核異染色質、常染色質及核比外表的測量結4討論我們采用nA復制肝損傷小鼠模型，小鼠血清ALT，TBIL在注射后6h到達峰值，與文獻報道根本一致3。通過對實驗各組肝組織超微構造的觀察分析顯示，模型組肝細胞的損傷主要表現(xiàn)有肝細胞出現(xiàn)細小脂滴，說明局部肝細胞出現(xiàn)脂代謝障礙。其機理分析為肝細胞線粒體和內質網(wǎng)受到嚴重的損傷，造成能量代謝障礙，ATP生成減少，同時蛋白質代謝也發(fā)生障礙;主要內質網(wǎng)明

7、顯減少且內質網(wǎng)內出現(xiàn)泡狀構造的改變。從立體計量學測得的結果可以看出，線粒體的Vv明顯減小，說明細胞內線粒體數(shù)目減少，線粒體的縮小說明線粒體體積增大,而線粒體的比膜面明顯減少，提示線粒體體積增大是水腫造成的，而線粒體嵴縮短模糊或消失，嵴間腔擴大，因此比膜面減少而功能降低，生成ATP障礙。研究說明，模型組肝細胞的損傷主要嚴重影響細胞的能量代謝和蛋白質代謝，而對核酸的代謝影響不大,從核外表出現(xiàn)發(fā)芽的現(xiàn)象并有異染色質電子密度增高所提示，nA性肝損傷的發(fā)活力制與肝細胞凋亡有關，與文獻報道相符4，5。QSYF各組在核形態(tài)構造上均未發(fā)現(xiàn)有核出芽現(xiàn)象和異染色質電子密度增高的現(xiàn)象，提示QSYF對nA誘導的肝細胞凋亡具有拮抗作用,并隨著劑量的增加肝細胞質內脂滴逐漸減少，線粒體、內質網(wǎng)增多，研究結果說明QSYF通過增強線粒體的數(shù)目和功能、增強蛋白質的代謝，發(fā)揮保護肝細胞的作用，減輕肝損傷，其量效關系呈正相關?！緟⒖嘉墨I】1曲建慧，張修禮.nA小鼠肝損傷模型的研究及應用J.肝臟，2001，6(3)：180.2胡水清，黃依雯，秦偉，等.nA誘導小鼠肝損傷模型的發(fā)病機制J.中國血液流變學雜志，2022，17(1)：159.3李敏，李衛(wèi)東.nA引起小鼠肝損傷實驗研究J.中國比擬醫(yī)學雜志，2022，18(7)：13.4王天才，李小剛，武忠