自制多聚胺陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率及細胞毒性的評價

1、廉價多聚胺陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染服從及細胞毒性的評價孫瑞琳，金發(fā)光，吳道澄，吳紅，劉彬，溫德升【關(guān)鍵詞】多聚胺陽離子脂質(zhì)體；制備；轉(zhuǎn)染Evaluatinftransfetineffiienyandyttxiityfselfpreparedplyaineatinilipse【Keyrds】plyaineatinilipse;preparatin;transfet【摘要】目的：評估制備的多聚胺陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染服從及細胞毒性.要領(lǐng)：多聚胺陽離子脂質(zhì)Thl與中性磷脂DPE以31摩爾比，制備多聚胺陽離子脂質(zhì)體，通過轉(zhuǎn)染以加強型綠色熒光卵白為陳訴基因的質(zhì)粒PIRES2EGFP入HeLa細胞,H

2、ep2細胞，倒置熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染細胞的陳訴基因表達，通過TT法，檢測細胞存活分數(shù)，并以Lipfetaine2000為比擬，評價制備陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染服從及細胞毒性.結(jié)果：多聚胺陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染服從略低于Lipfetaine2000，但細胞毒性較低,為一種相對高效低毒的陽離子脂質(zhì)體.結(jié)論：多聚胺陽離子脂質(zhì)體為一種相對高效低毒的陽離子脂質(zhì)體，在基因轉(zhuǎn)染和基因治療方面具有較遼闊的遠景.【關(guān)鍵詞】多聚胺陽離子脂質(zhì)體；制備；轉(zhuǎn)染0弁言基因治療可否樂成最緊張的影響因素是基因轉(zhuǎn)染載體.陽離子脂質(zhì)體能與目的基因以靜電作用相結(jié)合，可攜帶的外源基因容量較大,且不含抗原身分，細胞毒性低，可被機體落解，能屢次重復(fù)轉(zhuǎn)

3、染，因此成為一種有臨床應(yīng)用潛力的基因轉(zhuǎn)染載體1.多聚胺陽離子脂質(zhì)體(plyaineatinilipse,PL)易與核酸形成靜電復(fù)合物而自由通過親脂性膜，因此，是陽離子脂質(zhì)體中結(jié)果較好的核酸運載載體2.本研究旨在以Invitrgen公司陽離子脂質(zhì)體Lipfetaine2000為比擬，轉(zhuǎn)染帶有加強型綠色熒光卵白EGFP質(zhì)粒PIRES2EGFP入HeLa細胞或Hep2細胞，通過熒光顯微鏡不雅察陳訴基因的表達，評價PL的轉(zhuǎn)染服從，通過TT法檢測細胞存活分數(shù)，評價廉價PL的細胞毒性.1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1質(zhì)料ThlSiga，二油酰磷脂酰乙醇胺DPESiga，Lipfetaine2000(Invitrgen)

4、，質(zhì)粒PIRES2EGFP，感覺態(tài)細胞DH5均由我校免疫教研室楊安鋼傳授惠贈，質(zhì)粒微量抽提試劑盒安徽優(yōu)晶生物工程，DE造就基(Gib)，胎牛血清(天津TBD)，24孔造就板range，96孔造就板range，TTAres.1.2要領(lǐng)2結(jié)果2.1轉(zhuǎn)染服從評價A：PL轉(zhuǎn)染HeLa細胞后48h；B：PL轉(zhuǎn)染Hep2細胞后48h；：Lipfetaine2000轉(zhuǎn)染HeLa細胞后48h；D：Lipfetaine2000轉(zhuǎn)染Hep2細胞后48h.圖1PL或Lipfetaine2000轉(zhuǎn)染PIRES2EGFP入HeLa細胞或Hep2細胞10略aP0.05vsLipfetaine2000組.圖2PL,Lipf

5、etaine2000轉(zhuǎn)染PIRES2EGFP入HeLa細胞、Hep2細胞轉(zhuǎn)染服從比力略2.2細胞毒性評價TT法別離比力PL，Lipfetaine2000轉(zhuǎn)染HeLa細胞48h后存活分數(shù)，別離為87.44.6%，70.33.0%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)闡發(fā)，二者有明顯性差異P0.05；檢測PL,Lipfetaine2000轉(zhuǎn)染后Hep2細胞48h后存活分數(shù)別離為88.23.5%,69.44.3%,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)闡發(fā)，二者有明顯性差異P0.05.結(jié)果表白，PL細胞毒性低于Lipfetaine2000.3討論影響基因轉(zhuǎn)染服從的因素許多3，包羅細胞種類，轉(zhuǎn)染時間，載體布局，脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物內(nèi)部凈電荷數(shù)目8，脂質(zhì)體粒徑

6、巨細等方面，別的Li等9以為脂質(zhì)體DNA復(fù)合物中兩者比例對基因轉(zhuǎn)染服從也有緊張的影響.我們在前期試驗中制備四種PL，并根據(jù)PL與DNA的差異質(zhì)量比，通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PIRES2EGFP入HeLa細胞，檢測轉(zhuǎn)染后差異時間的轉(zhuǎn)染服從和細胞存活分數(shù)，創(chuàng)造轉(zhuǎn)染后48h，轉(zhuǎn)染服從最高，陽離子脂質(zhì)體與DNA結(jié)合比例為341時，同時挑選出相對高效低毒PL.本研究使用前期制備并挑選出的PL，接納前期實行挑選的PL與DNA比例，轉(zhuǎn)染時間等參數(shù)，通過轉(zhuǎn)染攜帶綠色熒光卵白陳訴基因的質(zhì)粒PIRES2EGFP進入HeLa細胞，Hep2細胞，通過熒光顯微鏡檢測EGFP的表達，反響PL的轉(zhuǎn)染服從，研究創(chuàng)造，本實行制備的PL轉(zhuǎn)染

7、服從略低于Lipfetaine2000.轉(zhuǎn)染HeLa細胞、Hep2細胞，前者轉(zhuǎn)染服從較高，其機制尚不明晰，思量大概與細胞攝取本擁有關(guān)，但尚不克不及以為HeLa細胞攝取任何脂質(zhì)體的本領(lǐng)均強于Hep2細胞.通過TT法檢測細胞存活分數(shù)，實行創(chuàng)造，轉(zhuǎn)染后48h,PL組較Lipfetaie2000組表示出較小的細胞毒性，思量PL同Lipfetaine2000比擬，其疏水基團前者為膽固醇，后者為兩條長鏈脂肪酸鏈，而膽固醇身分同細胞膜布局身分雷同有關(guān)，因此細胞毒性較小.同時有學(xué)者報道，多聚胺膽固醇陽離子脂質(zhì)以膽固醇基團交換兩條長鏈脂肪酸后，從而親水基團與膽固醇基團形成“T空間布局3，且與DNA形成的復(fù)合物更

8、不變10，從而進步由其構(gòu)成的載體的轉(zhuǎn)染服從.綜上所述，本實行中樂成制備的PLThlDPE31摩爾比具有轉(zhuǎn)染服從較高，細胞毒性較小的特點，在基因治療方面具有遼闊的應(yīng)用遠景.【參考文獻】1Rpert.LipsesasagenedeliverysysteJ.BrazJedBilRes,1999,322:163-169.2LeeER,arshallJ,SiegelS,etal.DetailedanalysisfstruturesandfrulatinsfatinilipidsfrhigheffiientgenetransfertthelungJ.HuGeneTher,1996,714:1701-171

9、7.3JudithK,Guy,VeeraiahB,etal.NvelplyainlipidsenhanetheellularuptakeflignuletidesJ.JBilhe,1995,270:31391-31396.4XiangG,LeafH.AnvelatinilipsereagentfreffiienttransfetinfaalianellsJ.BiheBiphysResun,1991,179:280-285.6hiJS,LeeEJ,JangHS,etal.Neatinilipsesfrgenetransferintaalianellsithhigheffiienyandltxii

10、tyJ.Bihe,2001,12:108-113.7KiYJ,KiT,hungH,etal.TheeffetsfserunthestabilityandthetransfetinativityftheatinilipideulsinithvariusilsJ.IntJPhar,2022,25212:241-252.8韓一生，胡蘊玉，金格樂，等.脂質(zhì)體介導(dǎo)下重組pDNA3Hbp3轉(zhuǎn)染兔樞紐軟骨細胞的條件J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2001,2211:987-990.9Li,IshidaT,kadaY,etal.InreasedgeneexpressinbyatinilipsesTFL3inlungetastasesfllingintravenus