免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn)：沉淀反應(yīng)

1、免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn)：沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)（precipe taiton）是可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合所出 現(xiàn)的反。早在1897年Kraus就發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌培養(yǎng)液與相應(yīng)抗血清混合時(shí)可發(fā)生 沉淀反應(yīng)（precipe tai to n）是可溶性抗原與相應(yīng)抗 體特異性結(jié)合所出現(xiàn)的反。早在1897年Kraus就發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌培養(yǎng)液與相應(yīng)抗血 清混合時(shí)可發(fā)生沉淀反應(yīng)。1905年Bechhold把抗體放在明膠中，將抗原加于 其中，發(fā)現(xiàn)沉淀反應(yīng)可在凝膠中進(jìn)行。Oudin （1946）報(bào)告了試管免疫擴(kuò)散技 術(shù)，Mancini（1965）提出單向免疫擴(kuò)散技術(shù)，使定性免疫試驗(yàn)向定量化發(fā)展。 另一方面，免疫濁度法的出現(xiàn)，使沉

2、淀反應(yīng)達(dá)到快速、微量、自動(dòng)化的新階 段。沉淀反應(yīng)分兩個(gè)階段，第一階段發(fā)生抗原抗體特異性結(jié)合，第二階段形成可見的免疫復(fù)合物（參見第九章）。經(jīng)典的沉淀反應(yīng)在第二階段 觀察或測(cè)量沉淀線或沉淀環(huán)等來判定結(jié)果，稱為終點(diǎn)法；而快速免疫濁度法則 在第一階段測(cè)定免疫復(fù)合物形成的速率，稱為速率法?，F(xiàn)代免疫技術(shù)（如各種 標(biāo)記免疫技術(shù)）多是在沉淀反應(yīng)的基礎(chǔ)上建立起來的，因此沉淀反應(yīng)是免疫學(xué) 方法的核心技術(shù)。 第一節(jié) 液體內(nèi)沉淀試驗(yàn) 一、絮狀沉淀試驗(yàn)絮狀沉淀試驗(yàn)為歷史較久，又較有用的方法。該法要點(diǎn)是：將抗原與抗體溶液混合在一起，在電解質(zhì)存在下，抗原與抗體結(jié)合，形成絮狀沉 淀物。這種沉淀試驗(yàn)受到抗原和抗體比例的直接影響

3、，因而產(chǎn)生了兩種最適比 例的基本測(cè)定方法。（一）抗原稀釋法抗原稀釋法（Dean-Webb法）是將可 溶性抗原作一系列稀釋，與恒定濃度的抗血清等量混合，置室溫或37C反應(yīng) 后，產(chǎn)生的沉淀物隨抗原的變化而不同。表12-1系以牛血清白蛋白為例的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果。表12-1Dean-Webb定量沉淀試驗(yàn)管號(hào) 抗原 抗體 總沉淀量 反應(yīng)過剩物 抗原沉淀量 抗體沉淀量 沉淀 中 Ab/Ag10.0030.680.093Ab0.0030.09030.020.0050.680.145Ab0.0050.14028.030.0110.680.249Ab0.0110.23821.740.0210.680.422Ab0.0

4、210.40119.150.0320.680.571Ab0.0320.53916.860.0430.680.7340.0430.69116.170.0640.680.720Ab80.0850.680.601Ag90.1710.680.464Ag10 0.341 0.68 0.368 Ag單位：mmol/L 從表 12-1 可以看出，15管為抗體過剩管，710管為抗原過剩管，唯第6管沉淀物最多，兩 者之比為16:1，即最適比。（二）抗體稀釋法（Ramon）法本法采用恒定的 抗原量與不同程度稀釋的抗體反應(yīng)，計(jì)算結(jié)果同上法，得出的是抗體結(jié)合價(jià)和 最適比。 現(xiàn)今，為了取得抗原與抗體的最佳比例，已將以上

5、兩法相結(jié)合，即抗 原和抗體同時(shí)稀釋，稱為棋盤格法（亦稱方陣法），找出最佳配比。舉例見表 12-2。 表12-2方陣最適比測(cè)定抗體稀釋度 抗原稀釋度1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/12 對(duì)照1/5 1/10 1/20 1/40 1/80 “”為沉淀物量：為最適比 從 表 12-2 可以看出，方陣法可較正確地找出抗原與抗體的最適比。如抗體用 1:40?？乖瓌t按1:320 稀釋；如抗原是 1:160，抗本則用 1:20 最為恰當(dāng)。 二、環(huán)狀沉淀試驗(yàn) 環(huán)狀沉淀試驗(yàn)是 Ascoli 于 1902年建立的，其方法是：先將 抗血清加入內(nèi)徑1.52mm小玻管中，

6、約裝1/3高度，再用細(xì)長滴管沿管壁疊加 抗原溶液。因抗血清蛋白濃度高，比重較抗原大，所以兩液交界處可形成清晰 的界面。此處抗原抗體反應(yīng)生成的沉淀在一定時(shí)間內(nèi)不下沉。一般在室溫放置 10min 至數(shù)小時(shí)，在兩液交界處呈現(xiàn)白色環(huán)狀沉淀則為陽性反應(yīng)。本技術(shù)的敏 感度為320 m g/ml抗原量。環(huán)狀試驗(yàn)中抗原、抗體溶液須澄清。該試驗(yàn)主要 用于鑒定微量抗原，如法醫(yī)學(xué)中鑒定血跡，流行病學(xué)用于檢查媒介昆蟲體內(nèi)的 微量抗原等，亦可用于鑒定細(xì)菌多糖抗原。因該技術(shù)敏感度低，且不能作兩種 以上抗原的分析鑒別，現(xiàn)已少用。 第二節(jié) 凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn) 最常用的凝膠為 瓊脂糖。由于凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)具有高度的敏感性和特異性，且

7、設(shè)備簡單、操作 方便，因而得到廣泛應(yīng)用。 該試驗(yàn)利用可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散， 形成濃度梯度，在抗原與抗體濃度比例恰當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉 淀環(huán)。適宜濃度的凝膠可視為一種固相的液體，水分占 98以上，凝膠形成網(wǎng) 絡(luò)，將水分固相化?？乖涂贵w蛋白質(zhì)在此凝膠內(nèi)擴(kuò)散，猶如在液體中自由運(yùn) 動(dòng)。大分子（分子量為 20 萬以上）物質(zhì)在凝膠中擴(kuò)散較慢，可利用這點(diǎn)識(shí)別分 子量的差別。另外，由于瓊脂網(wǎng)孔有一定的限度，抗原抗體結(jié)合后，復(fù)合物的 分子量至少應(yīng)在百萬以上，這種超大分子則被網(wǎng)絡(luò)在瓊脂中，經(jīng)鹽水浸泡也只 能去除游離的抗原或抗體，這對(duì)后面的分析帶來極大的方便。 凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn) 可根據(jù)抗原與

8、抗體反應(yīng)的方式和特性，分為單向擴(kuò)散試驗(yàn)和雙向擴(kuò)散試驗(yàn)。 一、單向擴(kuò)散試驗(yàn) 本試驗(yàn)是在瓊脂膠中混入一定量抗體，使待測(cè)的抗原溶液從 局部向瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見的沉淀環(huán)。根據(jù)試驗(yàn)形成可分 為試管法和平板法兩種。 （一）試管法 該方法由 Oudin 于 1946年報(bào)道。將血 清或純化抗體混入約50C的0.7%瓊脂糖溶液中，注入小口徑試管內(nèi)，待凝固 后，在凝膠中面加入抗原溶液，讓抗原自由擴(kuò)散入凝膠內(nèi)，在抗原與抗體比例 恰當(dāng)位置形成沉淀環(huán)。在黑色背景斜射光處，極易觀察這種白色不透明沉淀 帶。 沉淀環(huán)的數(shù)目和形態(tài)受抗原和抗體性質(zhì)的影響。溶液內(nèi)含有多種抗原，在 凝膠中含有各自的抗體，擴(kuò)散后形成

9、相應(yīng)的抗原抗體復(fù)合物，出現(xiàn)多條區(qū)帶。 試管上部的沉淀帶表示抗原量少或者抗體量多；反之，下面的沉淀帶則是抗原 量大，抗體量少。另外，抗體類型也有很大區(qū)別，如用兔抗血清（R型抗體），抗體過量亦可形成復(fù)合物，因而沉淀帶寬而界線不清；如用馬抗血清（H 型抗體），抗原或抗體過量皆不形成復(fù)合物，因而只在比例合適處形成界線清 晰的沉淀物（圖 12-1）。圖 12-1 兩種抗血清形成的沉淀帶示意圖 （二）平板法 此法由 Mancini于1965年提出，是目前最常用的簡易抗原定量技術(shù)，其要點(diǎn)是：將抗 體或抗血清混入0.9%瓊脂糖內(nèi)（約50C），未凝固前傾注成平板，凝固后在 瓊脂板上打孔（一般直徑約35mm），孔

10、中加入抗原溶液，放室溫或37C讓其 向四周擴(kuò)散， 2448h 后可見周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)（圖 12-2）。圖12-2 單向輻射狀免疫擴(kuò)散 上排為 5 個(gè)不同的參考中、下排為患者 血清 下排右 2 為一異常病理血清 由于試驗(yàn)中抗原向四周擴(kuò)散，故又稱單向輻 射狀免疫擴(kuò)散（singleradialimmunodeffusion, SRID）。最后，測(cè)量沉淀環(huán)的 直徑或計(jì)算環(huán)的面積。沉淀環(huán)直徑或面積的大小與抗原量相關(guān)，但不是直線相 關(guān),而是對(duì)數(shù)關(guān)系。同時(shí),這種沉淀還與分子量和抗散時(shí)間有關(guān)?？乖颗c 環(huán)徑的關(guān)系有兩種計(jì)算方法： 1Mancini 曲線適用于大分子抗原和長時(shí)間擴(kuò) 散（48h）的結(jié)果處理。使用方

11、格計(jì)算紙劃線，擴(kuò)散環(huán)直徑的平方與抗原濃度 呈線性關(guān)系（圖12-3）。利用公式表示：C/d2 = K圖 12-3Mancini 曲線 T1 為 1624h； T2 為 2448h； T3 為 48h 以上； 可見T3為直線，T1為反拋物線 式中C =抗原濃度，d =沉淀環(huán)直徑，=常 數(shù)。2. Fahey曲線這種曲線適用于小分子抗原和較短時(shí)間（24h）擴(kuò)散的結(jié)果 處理。使用半對(duì)數(shù)劃線，濃度的對(duì)數(shù)與擴(kuò)散圈直徑之間呈線性關(guān)系（圖 12- 4）。用公式表示：log/d = K式中。=抗原濃度（mg/d），d =沉淀環(huán)直徑，K 二發(fā)常數(shù)。各種蛋白質(zhì)只要符合以下3條，幾乎皆可用SRID定量測(cè)定：備 有僅對(duì)某

12、待測(cè)抗原的單價(jià)特異抗血清；備有已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品；待測(cè)品含 量在1.25p g/ml以上（單向擴(kuò)散技術(shù)的敏感度）?，F(xiàn)在最常用于臨床檢測(cè)的項(xiàng) 目有IgG、IgA、IgM、C3、C4、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等 多種血漿蛋白。 在檢測(cè)標(biāo)本的同時(shí)，用已知含量的標(biāo)準(zhǔn)抗原作57個(gè)稀釋 度，同時(shí)測(cè)量圈的大小（見圖12-2）。按擴(kuò)散時(shí)間（Fahey和Mancini法）的 不同，取方格紙或?qū)?shù)紙做標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。 單向瓊脂免疫擴(kuò)散法作為抗原的定量 方法，其重復(fù)性和線性皆是可信賴的，唯敏感度稍差（不能測(cè)p g/ml以下含 量）。另外，以下影響因素也應(yīng)注意。 1.抗血清不但要求親和力強(qiáng)、特異性 好、效價(jià)高

13、，而且還應(yīng)注意存放的方法，防止效價(jià)下降。 2.標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定必 須同時(shí)制作，決不可一次做成，長期應(yīng)用。 3.測(cè)定時(shí)必須同時(shí)加測(cè)質(zhì)控血 清，以保證測(cè)量準(zhǔn)確性。 4.有時(shí)出現(xiàn)擴(kuò)散圈呈兩重沉淀環(huán)的雙環(huán)現(xiàn)象。這是 由于出現(xiàn)了不同擴(kuò)散率、但抗原性相同的兩個(gè)組分。例如a重鏈病血清中出現(xiàn) 的a重鏈和正常IgA發(fā)生反應(yīng)，就形成內(nèi)外兩重環(huán)（圖12 2）。圖 12-4Fahey 曲線 t1 為 1624h； t2 為 2448h； t3 為 48h 以上可見 t1 為直線， t3 為拋物線 5.在單向擴(kuò)散試驗(yàn)時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)結(jié)果與真實(shí)含量不 符，這主要出現(xiàn)在Ig測(cè)定中。如用單向克隆抗體或用骨髓抗原免疫動(dòng)物獲得的 抗血

14、清，都存在結(jié)合價(jià)單一的現(xiàn)象，若用此作為單向擴(kuò)散試劑測(cè)量正常人的多 態(tài)性抗原，則抗體相對(duì)過剩，使沉淀圈直徑變小，測(cè)量值降低。 6.測(cè)得結(jié)果 的假陽性升高現(xiàn)象與上面相反，如用多克隆抗體測(cè)定單克隆病（M蛋白），則 抗原相對(duì)過剩（單一抗原決定簇成分），致使沉淀圈呈不相關(guān)的擴(kuò)大，從而造 成某一成分的偽性增加。 二、雙向擴(kuò)散試驗(yàn) 在瓊脂內(nèi)抗原和抗體各自向?qū)Ψ?擴(kuò)散，在最恰當(dāng)?shù)谋壤幮纬煽乖贵w沉淀線，觀察這種沉淀線的位置、形狀 以及對(duì)比關(guān)系，可作出對(duì)抗原或抗體的定性分析。雙向擴(kuò)散也可分為試管法和 平板法兩種方法。（一）試管法 試管法由Oakley首先報(bào)道。先在試管中加入 含抗體的瓊脂，凝固后在中間加一層普

15、通瓊脂，冷卻后將抗原液體加到上層。 放置后，下層的抗體和上層的抗原向中間瓊脂層內(nèi)自由擴(kuò)散，在抗原與抗體濃 度比例恰當(dāng)處形成沉淀線。此法分析效果與Oudin法相似，在臨床檢驗(yàn)中罕 用。（二）平板法 平板法由Ouchterlony首先報(bào)道，是抗原抗體鑒定的最基 本方法之一。該法的基本步驟是：在瓊脂板上相距35mm打一對(duì)孔，或者打梅 花孔、雙排孔、三角孔等（圖 12-5）。在相對(duì)的孔中加入抗原或抗體，置室溫 或37C1824h后，凝膠中各自擴(kuò)散的抗原和抗體可在濃度比例適當(dāng)處形成可 見的沉淀線。根據(jù)沉淀線的形態(tài)和位置等可作如下 3 種分析。 1抗原或抗體 的存在與否及其相對(duì)含量的估計(jì)沉淀線的形成是根據(jù)

16、抗原抗體兩者比例所致。 沉淀線如靠近抗原孔，則指示抗體含量較大；如靠近抗體孔，則指示著抗原含 量較多。不出現(xiàn)沉淀線則表明抗體或抗原過剩。另外，如出現(xiàn)多條沉淀線，則 說明抗原和抗體皆不是單一的成分。因此，可用于鑒定抗原或抗體的純度。圖 12-5 雙擴(kuò)散各種孔型圖 2 抗原或抗體相對(duì)分子量的分析抗原或抗 體在瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，其速度受分子量的影響。分子量小者擴(kuò)散快，反之則較 慢。由于慢者擴(kuò)散圈小，局部濃度較大，形成的沉淀線彎向分子量大的一方。 如若兩者分子量相等，則形成。圖 126 顯示左側(cè)沉淀線抗原分子量大于抗 體，右側(cè)沉淀線則抗體大于抗原，中間一條線則為兩者相等?？贵w多為 IgG， 分子量約15

17、kD，未知抗原的分子量可做粗略估計(jì)。圖 12-6 抗原抗體相對(duì)分子量示意圖 3用于抗原性質(zhì)的分析兩種受檢 抗原的性質(zhì)完全相同、部分相同或完全不同。三種情況在雙向擴(kuò)散中表現(xiàn)的基 本圖形見圖12-7。從圖12-7可以分析出，左圖中兩種受檢抗原（Ag-a）完全 相同，形成一個(gè)完全融合的沉淀線；右圖中抗體為雙價(jià)，兩種抗原完全不同 （Ag-a和Ag-c）；中圖的抗體為雙價(jià)，兩種抗原（Ag-ab和Ag-ac）皆有相同 的 a 表位，又有不同的 b 和 c 表位，所以沉淀線呈部分融合的形狀。這種技術(shù) 作為抗原的分析，是目前免疫化學(xué)中最常用的鑒定技術(shù)之一。圖12-7三種擴(kuò)散基本圖型 4用于抗體效價(jià)的滴定雙向擴(kuò)

18、散技術(shù)是抗 血清抗體效價(jià)滴定的常規(guī)方法。固定抗原的濃度，稀釋抗體；或者抗原、抗體 雙方皆作不同的稀釋，經(jīng)過自由擴(kuò)散，形成沉淀線。出現(xiàn)沉淀線的最高抗體稀 釋度為該抗體的效價(jià)。 第三節(jié) 免疫電泳技術(shù) 免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉 淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。這種技術(shù)有兩大優(yōu)點(diǎn)，一是加快了沉淀反應(yīng)的速度，二是 將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應(yīng)，以此作 更細(xì)微的分析。免疫電泳技術(shù)的種類很多，這里僅將常用的技術(shù)介紹如下。 一、免疫電泳 免疫電泳為區(qū)帶電泳與免疫雙向擴(kuò)散的結(jié)合，是由 Grabar 和 Williams （1953）首先報(bào)道的。方法是先利用區(qū)帶電泳技術(shù)將不同電荷和分子 量的蛋

19、白抗原在瓊脂內(nèi)分離開，然后與電泳方向平行在兩側(cè)開槽，加入抗血 清。置室溫或37C使兩者擴(kuò)散，各區(qū)帶蛋白在相應(yīng)位置與抗體反應(yīng)形成弧形沉 淀線（圖12-8）。根據(jù)各蛋白所處的電泳位置，可分為白蛋白區(qū)、球蛋白a 1 區(qū)、a 2區(qū)、0區(qū)和y區(qū)。各區(qū)帶常見血漿蛋白見表12-3和圖12-9。圖12-8免疫電泳擴(kuò)散模式圖A1b:白蛋白表12-3血漿免疫電泳各區(qū) 帶所含蛋白成分ALB a 1 a 2 0 y白蛋白 a 1-抗胰蛋白酶 觸珠蛋白 轉(zhuǎn)鐵蛋白 IgG 前白蛋白 a 1-酸糖蛋白 銅藍(lán)蛋白 C3a、 C3b CRP a 1脂蛋白抗糜蛋白酶2-巨球蛋白IgA、IgM、IgD、纖維蛋白原、 0 1 脂蛋白

20、、血凝素圖12-9血漿蛋白各區(qū)帶位置示意圖PreALB:前白蛋白；HP：觸珠蛋 白；a 1脂蛋白；ALB:白蛋白；TRF：轉(zhuǎn)鐵蛋白0 LIP： 0脂蛋白；AAT：抗胰 蛋白酶；AAG：酸糖蛋白；a 2M： a 2巨球蛋白免疫電泳沉淀線的數(shù)目和分辨 率受許多因素影響。首先是抗原與抗體的比例，同其它沉淀反應(yīng)一樣，要預(yù)測(cè) 抗體與抗原的最適比；其次是抗血清的抗體譜，一只動(dòng)物的抗血清往往缺乏某 些抗體，如將幾只動(dòng)物或幾種動(dòng)物的抗血清混合使用，則效果更好；電泳條 件，如緩沖液、瓊脂和電泳等皆可直接影響沉淀線的分辨率。對(duì)于免疫電泳的 分析，更重要的是經(jīng)驗(yàn)的積累，只有多看，多對(duì)比分析，才能作出恰當(dāng)?shù)慕Y(jié) 論。

21、免疫電泳目前大量應(yīng)用于純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常體液蛋 白的識(shí)別等方面。 二、對(duì)流免疫電泳 對(duì)流免疫電泳實(shí)質(zhì)上是定向加速度的免 疫雙擴(kuò)散技術(shù)，其基本原理是：在瓊脂板上打兩排孔，左側(cè)各孔加入待測(cè)抗 原，右側(cè)孔內(nèi)放入相應(yīng)抗體，抗原在陰極側(cè)，抗體在陽極側(cè)。通電后，帶負(fù)電 荷的抗原泳向陽極抗體側(cè)，而抗體藉電滲作用流向陰極抗原側(cè)，在兩者之間或 抗體的另一側(cè)（抗原過量時(shí)）形成沉淀線（圖 12-10）.圖12-10對(duì)流電泳結(jié)果示意圖Ag為陽性；Ag為弱陽性；Ag為 強(qiáng)陽性；Ag為強(qiáng)陽性IgG作為蛋白質(zhì)在電泳中比較特殊，4個(gè)亞型有不同的 表現(xiàn)。G3和G4與一般蛋白無異，泳向陽極；而G1和G2則因其帶

22、電荷少，受 電滲的作用力大于電泳，所以被水分子攜裹向陰極移動(dòng)。這就形成了 IgG 的特 殊電泳形式：一部分泳向陽極，另一部分泳向陰極，在抗體孔兩側(cè)皆有抗體存 在。因此，所謂對(duì)流只是部分 IgG 的電滲作用造成。 三、火箭免疫電泳 火箭 免疫電泳技術(shù)又稱作單向電泳擴(kuò)散免疫沉淀試驗(yàn)，它是由單向擴(kuò)散發(fā)展起來的 一項(xiàng)定量技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是加速度的單向擴(kuò)散。在含抗體的瓊脂板一端打一排抗 原孔；加入待測(cè)標(biāo)本后，將抗原置陰極端，用橫距23mA/cm的電流強(qiáng)度進(jìn)行 電泳。抗原泳向陽極，在抗原抗體比例恰當(dāng)處發(fā)生結(jié)合沉淀。隨著泳動(dòng)抗原的 減少，沉淀逐漸減少，形成峰狀的沉淀區(qū)，狀似火箭（圖 12-11）。抗體濃度 保持不變，峰的高度與抗原量呈正比，用標(biāo)本中的抗原含量。圖12-11火箭電泳圖為標(biāo)本；為標(biāo)準(zhǔn)抗原火箭電泳操 作時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)： 1所用瓊脂可選擇無電滲或電滲很小的，否則火箭形 狀不規(guī)則。 2注意電泳終點(diǎn)時(shí)間，如火箭電泳頂部呈不清晰的云霧狀或圓形 皆提示未