一氧化氮―一氧化氮合酶系統(tǒng)與骨折愈合

1、一氧化氮一氧化氮合酶系統(tǒng)與骨折愈合【關(guān)鍵詞】一氧化氮一氧化氮(nitrixide，N)是在一氧化氮合酶(nitrixidesythase,NS)作用下氧化產(chǎn)生的一種小分子自由基氣體。由于其分子量小，脂溶性及化學(xué)性質(zhì)活潑，因此極易透過生物膜，是細(xì)胞間、細(xì)胞內(nèi)的重要信使分子。由于其合成易于調(diào)節(jié)，作為高級(jí)生物體，調(diào)節(jié)的有效信號(hào)在循環(huán)、呼吸、消化及內(nèi)分泌代謝等系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。近幾年來的研究發(fā)現(xiàn)，NNS系統(tǒng)對骨折愈合起重要作用。本文就NNS系統(tǒng)對骨折愈合的影響作一綜述。1N在骨組織中的合成N由L精氨酸(LArginine)氧化途徑產(chǎn)生，限速酶是NS。目前已證實(shí)骨組織中存在全部3個(gè)NS亞型1。神經(jīng)元

2、型(nNS，NS1)是a2+鈣調(diào)蛋白(aP)依賴的，主要存在于神經(jīng)元和某些上皮細(xì)胞。但破骨細(xì)胞(stelast，)和成骨細(xì)胞(steblast，B)體外培養(yǎng)中未發(fā)現(xiàn)，可能其來自于分布于骨組織內(nèi)血管中膜的神經(jīng)組織。誘生型(iNS，NS2)不依賴a2+aP可被細(xì)菌脂多糖(LPS)和或腫瘤壞死因子(TNF)、IL1等誘導(dǎo)表達(dá)，主要存在于巨噬細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。內(nèi)皮型(eNS,NS3)也是a2aP依賴型，多見于內(nèi)皮細(xì)胞。和破骨前體細(xì)胞(stelastprgenitr)、B和骨細(xì)胞(steyte)均既能表達(dá)eNS，又能表達(dá)iNS。在骨的微環(huán)境中，許多細(xì)胞可以產(chǎn)生N，如和成骨細(xì)胞(

3、steeyte)。但對N在骨的合成部位卻理解不多。有學(xué)者用免疫組化方法降低尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黃遞酶(NADPHd)技術(shù)來確定N在骨的活性部位。Shidt2認(rèn)為，NADPHd活性存在于鼠長骨內(nèi)，但這些細(xì)胞不能與NS特異抗體結(jié)合。也有人證實(shí)，活體NADPHd活性存在于,但不清楚這種活性是否來自NS。免疫學(xué)定位研究說明，eNS或NS存在于新別離培養(yǎng)的大鼠和用LPS培養(yǎng)的大鼠長骨中。免疫組化和原位雜交研究證明，骨髓巨噬細(xì)胞是iNS活性最主要的來源。2NS在骨折愈合過程中的表達(dá)及定位不同類型的NS在骨折愈合的不同時(shí)期，它們表達(dá)的強(qiáng)弱也有所不同。人和大鼠骨折過程中均發(fā)現(xiàn)了3種NS的存在，而在非骨折

4、的股骨皮質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)三種NSRNA的表達(dá)不同及酶的活性。在骨折愈合過程中，3種NS異構(gòu)體表達(dá)分布不一樣，即表現(xiàn)為時(shí)間相關(guān)性、細(xì)胞分布差異性。rbett等應(yīng)用免疫組織化學(xué)、蛋白印跡(esternblts)、L瓜氨酸酶法證實(shí)：在骨折愈合早期，皮質(zhì)骨血管和骨細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)eNS骨折后1d酶可觀察到活性；iNS在骨內(nèi)膜成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞內(nèi)表達(dá)程度下降(尤其是骨折后第2周)；骨折端那么沒有nNS的表達(dá)。eNS的增高和iNS的下降在骨折愈合早期是非常重要的，兩者均可促進(jìn)骨折愈合。Zhu等4通過半定量競爭性PR發(fā)現(xiàn)，在大鼠股骨骨折后第4d，3種類型的NSRNA的表達(dá)都增加。iNS在骨折后4、7d表達(dá)最多，主要

5、分布于骨膜骨痂和皮質(zhì)骨外表的細(xì)胞內(nèi)，骨折后14d骨痂中iNS下降到不可檢測的程度；eNS在骨折后7、14d表達(dá)最多，主要分布于軟骨區(qū)和血管周圍的細(xì)胞內(nèi)；nNS在骨折后14、21d表達(dá)最多，主要分布于纖維軟骨區(qū)內(nèi)纖維組織和骨痂間的區(qū)域。并推測在骨折愈合的不同時(shí)期應(yīng)用不同的NS抑制劑或刺激劑可以調(diào)節(jié)骨折的修復(fù)。盡管不同學(xué)者研究的結(jié)果有所不同，但結(jié)論共同點(diǎn)為3種類型的NS在骨折愈合的不同時(shí)期表達(dá)具有類型特異性和理論依賴性。而iNS和eNS間互相制約：iNS的增加伴隨著eNS的減少，或者eNS的增加伴著iNS的減少。3NNS系統(tǒng)在骨折愈合中的生物學(xué)作用31調(diào)節(jié)骨折部位的血管反響。充足的血流供給、適當(dāng)?shù)?/p>

6、血管反響對骨折的愈合起著關(guān)鍵作用。骨折后的最初30in內(nèi)部分血流量減少，24h后恢復(fù)正常，而3d后血流量增加了3倍。血流增多可能是由于部分血管的舒張和新生血管的生成。N在各種病理生理情況下可能是最有效的血管擴(kuò)張劑和血管形成的介質(zhì)。它在乙酞膽堿的作用下由內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放，通過松弛附近平滑肌而使血管擴(kuò)張。rbett等5發(fā)現(xiàn)，在骨折修復(fù)過程中，N對血管構(gòu)造具有功能性的時(shí)間依賴性效應(yīng)。骨折愈合早期，特別是在骨折后第1dN依賴性血管反響最強(qiáng)，并且局限于骨折部位。長骨骨折早期，骨折斷端的血流是降低的，在N作用下，血流在幾小時(shí)內(nèi)將恢復(fù)，并且隨骨折愈合進(jìn)程顯著增加。N主要通過增加血管平滑肌內(nèi)GP程度，使骨折

7、部位的血管擴(kuò)張，從而使骨折端血流增加，促進(jìn)骨折愈合。同時(shí)，N可調(diào)節(jié)骨髓的血液供給，加速生成血細(xì)胞，增加循環(huán)血流量。由此推測，eNS的表達(dá)可增加些流量，改善部分微循環(huán)，從而增強(qiáng)骨痂的生物力學(xué)性能。32調(diào)節(jié)堿性磷酸酶的活性堿性磷酸酶(alkalinephsphatase，ALP)的活性反映了成骨細(xì)胞的成骨活性。ALP是成骨細(xì)胞分化的早期指標(biāo)，其作用是水解有機(jī)磷酸釋放無機(jī)磷，用于羥基磷灰石的形成，因此是骨形成的特異性酶。Nakungatthai等6對大鼠股骨骨折后第4、7、14、28d的骨痂組織塊培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，骨折后第7d的骨痂組織塊ALP的活性最高，而骨折后第14d的骨痂組織塊ALP的活性最低。在培養(yǎng)

8、液中用NS抑制劑S(2ainethyl)isthiurniubridehydride與骨痂組織塊共同孵化，上述4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的骨痂組織塊的ALP活性均下降50，而低劑量(025lL)補(bǔ)充N供體3rphlinsydnninehydrhlride(SIN1)那么可使ALP活性增加20。ALPRNA和ALP被發(fā)現(xiàn)定位在骨痂內(nèi)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞和軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞內(nèi)。33NNS系統(tǒng)對的影響是骨中N的來源之一，通過輔酶黃遞酶染色，呈強(qiáng)陽性，證實(shí)了自身可生成N。目前認(rèn)為N對的作用主要涉及以下環(huán)節(jié)：331使胞漿收縮，降低外表積，改變形狀，抑制在骨基質(zhì)上粘附和質(zhì)子泵分泌H+功能，并直接抑制粘附機(jī)制，特別是整合素(inte

9、grin)、表達(dá)，引起脫離吸收部位，類似降鈣素的R效應(yīng)(retratinatin)。但并不影響細(xì)胞膜的運(yùn)動(dòng)，這是與降鈣素作用的不同點(diǎn)。332抑制破骨細(xì)胞前體增殖進(jìn)而抑制形成。在別離的鼠培養(yǎng)基中參加高濃度可溶性N氣體(30lL1)和N生成劑硝普鹽(001lL1)可抑制骨吸收。001lL的硝普鹽還可抑制甲狀旁腺(PTH)刺激骨吸收。雖然N在骨的產(chǎn)生與細(xì)胞內(nèi)的GP蓄積有關(guān)，但GP的類似物可能對骨吸收沒有直接作用。根底濃度的N是維持正常骨吸收功能所必需，適當(dāng)?shù)蜐舛萅可促進(jìn)破骨細(xì)胞前體向轉(zhuǎn)化。低濃度N還可增強(qiáng)IL1、TNF誘導(dǎo)的性骨吸收，如IL1、TNF結(jié)合作用產(chǎn)生的低濃度N，對骨吸收有顯著刺激作用；低

10、濃度的N供體S亞硝基乙酰青酶胺(SNAP)可增強(qiáng)IL1誘導(dǎo)的骨吸收。在炎癥條件下激活的T淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生干擾素(IFN)，而IFN可誘導(dǎo)N的產(chǎn)生，抑制由IL1與腫瘤壞死因子(TNF)引起的骨吸收并伴有數(shù)目減少；風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的IFN低于對照組。精氨酸的類似物硝基L精氨酸甲酯(LNA)可完全阻斷N的產(chǎn)生。這些資料說明，高濃度的N不僅抑制成熟的骨吸收而且還可抑制的產(chǎn)生。由此可見，N對骨的吸收有雙重調(diào)節(jié)作用即：高濃度N經(jīng)抑制形成和抑制成熟的吸收功能而抑制骨吸收；而低濃度N那么增強(qiáng)細(xì)胞素誘導(dǎo)的骨吸收，并且對正常的功能來說是必不可少的7。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.34NNS系統(tǒng)對B的影響最近的研究說明，B是

11、骨組織中N的又一重要來源。自然狀態(tài)下測定培養(yǎng)中的正常人松質(zhì)骨來源的B，發(fā)現(xiàn)其幾乎不產(chǎn)生N。目前認(rèn)為即使有N產(chǎn)生，其根底程度也較低8。炎性疾病時(shí)可激活iNS途徑以增加N產(chǎn)量，說明細(xì)胞因子誘導(dǎo)增加N的產(chǎn)生是通過激活iNS的合成。關(guān)于N對其靶細(xì)胞的作用機(jī)制目前尚不完全清楚，歸納起來有如下途徑：341N可與靶細(xì)胞內(nèi)鳥苷酸還化酶結(jié)合，進(jìn)步該酶活性，增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷(GP)含量，以GP為第2信使發(fā)揮其生物學(xué)作用。但GP類似物二丁基GP和8溴GP對N靶細(xì)胞無N樣作用不支持此觀點(diǎn)。342由于N可使形態(tài)發(fā)生變化，所以有學(xué)者提出N作用機(jī)理可能通過某些蛋白激酶或某些功能蛋白影響細(xì)胞骨架而起作用。有研究顯示：N對

12、B的影響存在一個(gè)閾值問題，中等量的N似乎對維持B的生長非常必要。當(dāng)N的合成超出閾值時(shí)，N對B有抑制作用，甚至毒性作用。NS競爭性抑制劑LNA可抑制人或鼠B增生，并呈劑量依賴性。在培養(yǎng)液中增加L精氨酸的濃度或補(bǔ)充N供體可阻止這種效應(yīng)。eNS在Rs1728細(xì)胞、G63細(xì)胞和人原始成骨細(xì)胞中表達(dá)。這些資料顯示，適當(dāng)劑量的N對調(diào)節(jié)B的生長有重要作用。高濃度N還可抑制前B內(nèi)3H胸腺嘧啶(3HTdR)攝入量9，抑制前成骨細(xì)胞增殖，影響B(tài)的形成。此外，較高濃度的N可促進(jìn)B凋亡，通過環(huán)氧酶(X)旁路抑制B堿性磷酸酶(ALP)活性并阻斷前列腺素(PG)對B的作用，并抑制B合成反映其活性的標(biāo)記物骨鈣素(BGP)，

13、從而抑制骨質(zhì)礦化。35NNS系統(tǒng)對軟骨細(xì)胞的影響正常情況下，軟骨細(xì)胞幾乎不產(chǎn)生N，且正常軟骨細(xì)胞中亦無iNS分布，而用IL1、腫瘤壞死因子(TNF)等激活后，iNS分布明顯增加，iNS選擇性抑制劑作用于骨關(guān)節(jié)炎軟骨，N的產(chǎn)生明顯減少。軟骨細(xì)胞需在IL1等細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下通過iNS催化產(chǎn)生N。N對軟骨細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)：(1)抑制軟骨細(xì)胞增殖：其作用機(jī)制可能有：可能通過GP增加，抑制DNA合成，從而抑制軟骨細(xì)胞增殖10；N可能促進(jìn)前列腺素(PGE2)的產(chǎn)生，通過PGE2抑制軟骨細(xì)胞增殖；N可能促進(jìn)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的合成釋放，通過bFGF抑制軟骨細(xì)胞的增殖；(2)抑制軟骨細(xì)胞的遷移、

14、粘附：軟骨細(xì)胞的遷移、粘附對軟骨的生長、發(fā)育有重要作用，IL1等細(xì)胞因子激活軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的N抑制軟骨細(xì)胞的遷移，也抑制軟骨細(xì)胞粘附到纖粘連蛋白(Fn)上，從而削弱軟骨的修復(fù)才能11；(3)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡：N供體在體外可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，IL1和氧自由基去除劑一同作用于軟骨細(xì)胞可引起細(xì)胞凋亡，在N產(chǎn)生減少的情況下，氧自由基引起軟骨細(xì)胞死亡，不是氧自由基而是N引起軟骨細(xì)胞凋亡；(4)引起或促進(jìn)軟骨細(xì)胞死亡：H22參加到IL1TNF處理和未處理的軟骨細(xì)胞中，前者的LD50僅是后者的非常之一，且增加的酶感性可被NS抑制劑徹底消除，N可能通過減弱軟骨細(xì)胞的去氧化劑的毒性作用直接引起或間接促進(jìn)軟骨細(xì)胞死

15、亡；(5)干擾軟骨細(xì)胞內(nèi)、外信息的傳遞：N供體或炎性細(xì)胞因子可阻斷Fn和粘合素51(Fn的受體)結(jié)合后引起的軟骨細(xì)胞內(nèi)一系列的激活與G蛋白相似的ras蛋白的合成、蛋白質(zhì)的磷酸化等，卻既不影響軟骨細(xì)胞和Fn的結(jié)合，也不影響粘合素51在細(xì)胞周圍的聚集，可見N干擾了軟骨細(xì)胞外信息向細(xì)胞內(nèi)傳遞，從而影響軟骨細(xì)胞的功能。4N供體促進(jìn)骨折愈合的應(yīng)用Baldik等12運(yùn)用iNS基因治療iNS缺陷大鼠來評價(jià)iNS對骨折愈合的作用。iNS基因缺陷大鼠骨折的股骨總能量吸收值和最大能量吸收值分別較野生型大鼠下降30和70。經(jīng)iNSDNA治療后可改善以上情況，并與改變強(qiáng)度相比顯著增加達(dá)20。rbett等5亦證明，脛骨

16、骨折和正常大鼠口服LNAE28d后，骨折端礦物質(zhì)含量和機(jī)械強(qiáng)度均較對照組明顯降低，說明N在骨折愈合過程中起重要的調(diào)節(jié)作用，并且N參與了正常骨礦物質(zhì)含量的調(diào)節(jié)。運(yùn)用賴氨酸和L精氨酸，可促進(jìn)成骨細(xì)胞釋放N，并增加I型膠原表達(dá)13。Baldik等14將36只成年SD雄鼠分為三組，與右側(cè)股骨中段造成5骨缺損。經(jīng)堅(jiān)強(qiáng)內(nèi)固定后，部分給予N供體亞硝基牛血清白蛋白和口服選擇性iNS抑制劑氨基胍后，應(yīng)用放射學(xué)和組織學(xué)觀察骨的形成和愈合情況，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組均比對照組明顯促進(jìn)骨的愈合。推測結(jié)合應(yīng)用N供體可在臨床上促進(jìn)骨折愈合。Jaal等15對317名英國女性骨質(zhì)疏松癥患者每天使用根底劑量的NG以及另外74名同性質(zhì)的骨質(zhì)

17、疏松癥患者周期性應(yīng)用2a硝酸甘油后，與未用藥組相比，每日用藥組足跟BD無明顯增加，髖部BD增加了13；而周期性用藥組足跟BD增加了53，髖部BD增加了26，同時(shí)骨折率下降。說明無論何種用藥方法，硝酸鹽均增加了BD，而周期性使用增加較顯著。參考文獻(xiàn)：1aballerAliasA,LveridgeN,LynA,etal.NSisfrsinadulthuansteytes:ultiplepathaysfNregulatinJ.alifTissueInt,2022,75(1):78-84.2ShidtHH,GagneGD,Nakane,etal.appingfneuralnitrixidesythas

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