細胞化學染色課件

1、關于細胞化學染色課件第一張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 一、概述 二、細胞化學染色的基本方法 三、臨床應用 2第二張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 1、概念： 細胞化學染色是細胞學和化學相結合而成的一門科學，以細胞形態(tài)學為基礎，結合運用化學反應的原理對血細胞內的各種化學物質（包括酶類、脂類、蛋白質、糖類、鐵、核酸等）作定性、定位、半定量分析的方法。3一、概 述第三張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 2.細胞化學染色的目的 （1）輔助判斷急性白血病的類型 （2）輔助血液系統等疾病的診斷與鑒別診斷第四張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 3.細胞化學染色的基本步

2、驟：包括固定、顯色反應、復染。（1）固定：為了保持細胞結構及化學成分的穩(wěn)定性而選用的方法。根據染色的目的，最常用的固定劑有甲醛、甲醇、乙醇等。 5第五張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 （2）顯色：通過不同的化學反應，最終形成穩(wěn)定的有色沉淀，使被監(jiān)測的化學物質顯示出來。包括 偶氮偶聯法：如NAP、ACP及各種脂酶染色 普魯氏藍反應：如鐵染色 雪夫（shiff）反應：如PAS染色 聯苯胺法：如POX染色 （3）復染：使各種目的細胞能顯示出來更便于觀察 6第六張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月過氧化物酶染色中性粒細胞堿性磷酸酶染色糖 原 染 色非特異性酯酶染色特異性酯酶染色骨髓鐵染

3、色7二、細胞化學染色的基本方法第七張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 1、原理： pox H2O2 O 聯苯胺 聯苯胺藍 + 亞硝基鐵氰化鈉8藍黑色顆粒（一)過氧化物酶(POX)染色第八張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 2.試劑 (1)聯苯胺酒精溶液： 取0.3g聯苯胺加亞硝基鐵氰化鈉飽合液（36%）1ml,再加95%乙醇至100ml，存在于棕色瓶中，可存一年。 (2) 稀過氧化氫（新鮮配制）：取50ml蒸餾水加30%H2O21滴。 （3）瑞吉氏復染液 9第九張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 3、染色方法 1、新鮮干燥涂片加聯苯胺酒精溶液10滴，覆蓋整個髓膜，固定1

4、-2min。 2、再加等量的稀H2O2，混勻后染色45min,勿倒去染液直接流水沖洗。 3、瑞氏染液復染。10第十張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 4、注意事項 （1）H2O2要新鮮配制，注意有效性 （2）標本要新鮮，最長不超過一周，時間長了酶活性減弱。 （3）POX染色后，一定要沖洗干凈，否則染料堆積或浮于表面，影響瑞氏染色結果觀察。11第十一張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 5、結果判定：中性粒細胞桿狀及分葉核呈強陽性是染色成功的標志(設對照片）。 在細胞的胞漿中出現藍綠色或藍棕色顆粒為陽性反應。12第十二張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月1.中性成熟粒細胞，呈

5、強陽性；2.晚幼紅細胞，呈陰性；3.單核細胞，呈弱陽性；4.漿細胞，呈陰性 第十三張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月14第十四張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月急性粒細胞白血?。∕2a) 的POX染色原始粒細胞均呈陽性 第十五張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月急性淋巴細胞白血病的POX染色1.中性成熟粒細胞，呈強陽性；其他原始淋巴細胞均呈陰性 第十六張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月急性早幼粒細胞白血病的POX染色.原始紅細胞，呈陰性；其他早幼粒細胞均呈強陽性 第十七張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月急性單核細胞白血病的POX染色1.中性成熟粒細胞，呈強

6、陽性；2.原始單核細胞，呈陽性；3.原始單核細胞，呈弱陽性；其他原幼單核細胞呈陰性 第十八張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 6、臨床意義 （1）正常分布 粒系:早期原粒陰性，晚期原粒及以下各階段呈不同程度陽性。 單核系:早期原單陰性，其它階段皆呈弱陽性。 淋巴、紅系、漿細胞、巨核均呈陰性。19第十九張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 （2）急性白血病的鑒別診斷 幼稚細胞POX陽性率3% ：急非淋（AML) 幼稚細胞POX陽性率3% ：急淋（ALL) 20第二十張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 （二）中性粒細胞堿性磷酸酶染色 （偶氮偶聯法）1.原理磷酸奈酚鈉 磷酸+萘

7、酚 偶聯萘酚+重氮鹽 不溶性有色沉淀物定位于胞漿 (堅固藍RR鹽) 21NAPPH9.29.8第二十一張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月22 2.試劑 （1）固定劑：10甲醛甲醇溶液 （2）Tris-Hcl緩沖液的配制：Tris粉三胺基甲烷4.85克溶于200ml蒸餾水中,加濃HCL1-2滴，PH調至9.2，4保存！ （3）作用(基質液): 磷酸萘酚鈉 5mg N-N二甲基酰胺 1ml Tris-Hcl液 4ml 堅固藍RR鹽 5mg （4）復染液：1%中性紅第二十二張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 3.操作步驟 1、新鮮、干燥的外周血或骨髓涂片（標本片及對照片）加固定劑作用

8、30秒（染缸），水洗待干； 2、滴加作用液，室溫染色15min，水洗待干； 3、1%中性紅復染1min23第二十三張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 4.注意事項 (1) 重氮鹽以堅固藍RR鹽為最佳； (2) 堅固藍RR鹽應適量：過多易造成染色失敗，過少使反應減弱； (3) 每次都要做陽性對照； (4) 作用液新鮮配制，配好后要立即使用24第二十四張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 5.結果觀察:(對照片成熟中性粒細胞中出現棕黑色顆粒為陽性細胞，說明染色成功) 正常人除成熟中性粒細胞NAP可見陽性外，其它血細胞均為陰性。且正常陽性率40%，積分值30130分。 25第二十五張，

9、PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月6.NAP陽性結果及積分判斷標準“” 0分，胞漿中無陽性顆?！?” 1分，胞漿中含有少量顆?！?+” 2分，胞漿中含有中等量顆?！?+” 3分，胞漿中含有豐富的顆粒，但胞核清楚“4+” 4分，胞漿中含有豐富粗大的顆粒，但胞核不清楚第二十六張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月中性粒細胞堿性磷酸酶染色1.中性成熟粒細胞（+）；2.中性成熟粒細胞（+）；3.中性成熟粒細胞（+）；4.中性成熟粒細胞（+）；5.淋巴細胞 （-）第二十七張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月28第二十八張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月29 NAP分級第二十九張，P

10、PT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 7.臨床意義 增高：細菌感染、類白、AA、急淋、慢粒急變、骨髓增殖性疾病，惡性淋巴瘤。 降低：慢粒、急粒、PNH、MDS、惡組30第三十張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 8.鑒別診斷 慢粒與類白：前；后。 PNH與AA：前；后。 急粒與急淋：前；后。 MDS與慢性再障：前；后。病毒感染與細菌感染：前者無明顯變化，后者。惡組與反應性組織細胞增多：前；后。 31第三十一張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）酯酶染色概述特異性酯酶染色非特異性酯酶染色第三十二張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 概 述 根據各類細胞所含酯酶特異性高低分為

11、特異性酯酶(SE)和非特異性酯酶(NSE)；特異性酯酶是指氯乙酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DCE）；非特異性酯酶根據水解基質液的PH不同，又分為中性NSE（-醋酸萘酚酯酶 ），酸性NSE（酸性-醋酸萘酚酯酶），堿性NSE（-丁酸萘酚酯酶）。 目前常用的是氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色NAS-DCE和-醋酸萘酚酯酶（-NAE）+ NaF抑制試驗。第三十三張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月1.原理（偶氮偶聯法）氯乙酸ASD萘酚 ASD萘酚 + 重氮鹽(堅固藍B鹽)34NAS-DCE不溶性有色沉淀物定位于胞漿內酶所在位特異性酯酶(CE)染色基質液基質液第三十四張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022

12、年6月 2.試劑： （1）固定液：10甲醛甲醇溶液 （2）作用液（基質液） 氯乙酸ASD萘酚 5mg 丙酮 5-8ml 磷酸鹽緩沖液 19ml 堅固藍B鹽 10mg （3）復染液：1%中性紅 35第三十五張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 3.染色方法（1）固定：10%甲醛甲醇液固定30秒，水洗晾干（2）滴加作用液37孵育30min，水洗（3）1%中性紅復染1min，水洗晾干鏡檢。36第三十六張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 4. 注意事項： 1.氯乙酸AS-D萘酚溶液應避光，4冰箱 保存，變黃或混濁即失效。 2.染色溫度37效果最好37第三十七張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2

13、022年6月 5.結果判斷 中性分葉核粒細胞胞漿中見細小，彌漫分布的藍色顆粒為染色成功的標志。 6.臨床意義 粒系除早期原粒外，其余階段細胞均為陽性，其它各系均為陰性。CE染色對粒細胞白血病有特異性的診斷價值。38第三十八張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月39CE第三十九張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 非特異性酯酶染色（-NAE）1. 原理： -醋酸萘酚 -萘酚 重氮鹽40-NAE形成不溶性有色沉淀定位于胞漿內酶所在位置7.47.6(堅固鹽B)第四十張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 2.試劑 （1）固定液：甲醛 （2）作用液: -醋酸萘酚 5mg 丙酮 5-8ml

14、 磷酸鹽緩沖液 10ml 固藍B鹽 10mg （3）復染液：10g/L甲基綠水溶液41第四十一張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月42 3.染色步驟 （1）甲醛蒸氣固定5-10min，流水沖洗5min晾干 （2）放入作用液371h,流水沖洗。 （3）10g/L的甲基綠溶液復染5min,水洗待干鏡檢 （4）NaF抑制試驗：在40ml作用液中加NaF15mg同樣染色后，油鏡計數100個被檢細胞，分別計算出抑制前和抑制后的陽性率和積分，按公式計算出抑制率，正常小于50%。第四十二張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 A圖：急性單核細胞白血病-NAE染色 原始、幼稚單核細胞多呈強陽性 B圖

15、：急性單核細胞白血病 -NAE氟化鈉抑制染色原始、幼稚單核細胞陽性反應被氟化鈉抑制（與A圖為同一標本） A B 第四十三張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 4.結果判斷：胞漿內有棕色或棕黑色沉淀物為陽性 染色成功指標：正常部分原始、幼稚及成熟單核細胞呈陽性；部分粒細胞為弱陽性反應；部分成熟淋巴或個別中、晚幼紅呈陽性。 44第四十四張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月45第四十五張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 5.臨床意義：鑒別急性白血病 （1）急單時，原始至成熟單核大多為-NAE陽性，且易被NaF抑制，抑制率正常大于50%。 （2）急粒時，白血病細胞多呈陰性或弱陽性，

16、M3呈陽性，但均不被NaF抑制。 酯酶雙染：同一張血涂片上的細胞分別在兩種不同的基質液中作用一定時間，復染鏡檢。主用于鑒別診斷AML-M4亞型。46第四十六張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月骨髓涂片特異性酯酶（CE）和非特異性酯酶（NAE）的雙酯酶染色顯示，原始粒細胞胞漿呈藍色CE陽性反應；而原始單核細胞胞漿呈棕色的NAE陽性反應。第四十七張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）糖 原 染 色(PAS)細胞內糖原中的乙二醇基48氧化過碘酸二醛基 1.原理（過碘酸-雪夫氏反應）二醛基經過加成和縮合使無色亞硫酸品紅恢復品紅的紅色失去亞硫酸定位于含有糖原的細胞內第四十八張，PPT共八

17、十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 2.試劑 （1）10g/L的過碘酸氧化劑 雪夫氏試劑（schiff）：紅色品紅與偏重亞硫酸鈉，變成了無色品紅。 20/L甲基綠復染液49第四十九張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 3.操作 （1）新鮮髓片放在95乙醇中固定10分鐘；蒸餾水沖洗待干； （2）10g/L過碘酸氧化15分鐘；蒸餾水沖洗； （3）置雪夫氏試劑浸泡45分鐘，水洗后涼干； （4）甲基綠復染15分鐘 ，水洗待干鏡檢。 50第五十張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 4.注意事項 （1）所用染色缸及器具應十分清潔、干燥。 （2）雪夫氏染液應避光密封保存，變紅則失效。 （3）放入雪夫氏

18、溶液之前，用蒸餾水洗涂片， 而且一定要完全干燥，若有水，試劑變色失效。51第五十一張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 （4）染色時間和溫度應相對恒定，一般37效果最好。 （5）染好的標本不能久放，8天后漸退色，因此應及時觀察。52第五十二張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 5.結果觀察 陽性：細胞漿內的紅色陽性物呈彌散狀、顆粒狀或塊狀，胞核染綠色。 陰性：胞漿無色或無紅色顆粒。 53第五十三張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 6.臨床意義 正常血細胞的染色反應 （1）粒系：原始細胞多為陰性，隨著細胞成 熟，陽性逐漸增強。 （2）淋系：正常人陽性率10-50%之間，多為

19、20%以下。 （3）紅系：PAS呈陰性反應 （4）巨核：PAS呈陽性反應 （5）單核系:呈陰性或細顆粒狀弱陽性。54第五十四張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月正常血細胞PAS染色1.原始粒細胞（-） 2.早幼粒細胞（+）3.中性中幼粒細胞（+）4.中性晚幼粒細胞（+）5.中性桿狀核粒細胞（+）6.中性分葉核粒細胞（+）7.嗜堿性粒細胞（+）8.嗜酸性粒細胞（+）9.單核細胞（） 10.淋巴細胞（+） 第五十五張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 疾病鑒別 （1）紅細胞系統疾病：M6、MDS呈陽性（均勻或塊狀紅色）；巨幼貧、再障呈陰性。 （2）白血?。?急淋及慢淋：粗顆?；驂K狀陽性

20、 急粒：陰性或弱陽性（彌散細顆粒） 急單：陽性，多為細顆粒有時可見粗顆粒 急性巨核細胞白血?。宏栃裕▔K狀） 56第五十六張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月PASAML-M6幼紅細胞呈陽性反應MA幼紅細胞呈陰性反應第五十七張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月急性淋巴細胞白血病PAS染色原始、幼稚淋巴細胞均陽性，呈粗顆粒狀陽性 第五十八張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月59急淋PAS陽性細胞第五十九張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月60PAS陽性的幼紅細胞第六十張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 1.原理(普魯氏藍反應) 4Fe3+ + K4Fe(CN)6 F

21、e4Fe(CN)63 +12K+ (亞鐵氰化鉀) (藍色亞鐵氰化鐵) 61（六）骨髓鐵染色 稀鹽酸細胞外鐵：主要存在于骨髓小粒的巨噬細胞中細胞內鐵：主要存在于有核紅細胞中第六十一張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 2.試劑 （1）固定液：甲醇 （2）酸性亞鐵氰化鉀溶液：200g/L亞鐵氰化鉀5份，濃鹽酸1份。取200g/L亞鐵氰化鉀溶液置于試管中，緩慢加入濃鹽酸，邊滴邊搖由開始的白色沉淀消失為至。 （3）復染劑：0.5%沙黃 62第六十二張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 3.操作步驟 （1）選片做標記，甲醇固定10min （2）37滴加酸性亞鐵氰化鉀溶液染色30min （3）

22、蒸餾水沖洗2min后沙黃復染1min，待干鏡檢。 63第六十三張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 4.注意事項 （1）所用的玻片及器具必須清潔，無鐵污染。 （2）應選有骨髓小粒的髓片做鐵染色，以便觀察細胞外鐵。 （3）作用液必須新鮮配制。 （4）亞鐵氰化鉀暴露于空氣中，易氧化變質， 貯于棕色瓶中，避光密封保存。 64第六十四張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 （5）復染前應充分沖洗，否則鐵粒狀結晶過多，影響觀察。（6）計數時要不停地旋轉細螺旋器，因為鐵粒在細胞內的高低度不一致，每看一個中、晚幼紅細胞要旋轉幾次，直到看清為止。 （7）觀察內鐵時，幼紅及淋巴細胞要分清，幼紅細胞核為

23、鮮紅色，淋巴細胞核為淡紅色，（8）與污染鐵的鑒別：污染鐵不在髓小粒和細胞內，而是浮在上邊，而且藍中帶黑。65第六十五張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 5.結果觀察： （1）正常幼紅細胞核呈鮮紅、漿淡黃、鐵顆粒呈藍綠色 （2）低倍鏡觀察細胞外鐵：涂片尾部和髓小粒附近 陰性：無藍綠色鐵粒。 陽性：含有不同程度的鐵粒、鐵小珠、鐵小塊。 根據陽性程度不同分四級。 66第六十六張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月67細胞外鐵幼紅細胞外的骨髓鐵 ( + ) 少量鐵粒 偶見鐵小珠 （2） 較多鐵粒較多鐵小珠 (3+) 許多鐵粒許多鐵小珠少量小塊狀。 (4+) 極多的鐵顆粒 鐵小珠 許多小塊密

24、集 成堆。第六十七張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月細胞外鐵觀察陽性為藍綠色沉淀第六十八張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）細胞內鐵：油鏡計數100個中晚幼紅細胞；并記 錄含有藍色顆粒的鐵粒幼紅細胞百分率。 型 胞漿內1-2個鐵小粒 型 胞漿內3-5個鐵小粒 型 胞漿內6-10個鐵小?；?-4粗大顆粒 型 含鐵小粒10個以上或5個以上粗大顆粒 環(huán)形鐵粒幼紅細胞：含鐵粒在6粒以上，其中2/3以上鐵粒圍繞核排列，超過1/2周。69第六十九張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月骨髓細胞內鐵染色1.環(huán)形鐵粒幼紅細胞；2.鐵粒幼紅細胞 第七十張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年

25、6月71第七十一張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 5.正常參考值 細胞外鐵：+（2/3為+，1/3為+） 細胞內鐵：20%40%（正常人型多見，少數為型）72第七十二張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 7.臨床意義： (1)缺鐵性貧血:外鐵或()，內鐵 15% 。 此方法是診斷IDA及指導鐵劑治療的一種輔助方 法；經鐵劑治療后細胞內外鐵迅速增多。 (2)鐵粒幼細胞性貧血：內鐵陽性率高于40%，可達70%以上，鐵粒數目增多，顆粒粗大，可見環(huán)鐵；外鐵多為+2，可達+3+4。 （3）MDS-RAS：內鐵陽性率，環(huán)鐵15%。73第七十三張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 （4

26、）感染性貧血：外鐵，內鐵 （5）地中海貧血：內鐵，外鐵 （6）巨幼細胞性貧血、溶血性貧血、再障、白 血?。和忤F 、內鐵正?；蛏?。74第七十四張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月三、臨床應用第七十五張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 對于貧血病例鐵染色應作為常規(guī)染色 外鐵或(-)，內鐵：在缺鐵性貧血。 內、外鐵正?；蛟龆啵壕抻准毎载氀⑷苎载氀?、再生障礙性貧血。 外鐵增多，內鐵減少：感染性貧血、肝病性貧血、腎病性貧血。 內、外鐵均增多： 增生異常綜合癥（MDS）、鐵粒幼細胞性貧血。76一、在貧血診斷中的應用第七十六張，PPT共八十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 在巨幼細胞性貧血和紅血病或紅白血病，作PAS染色。 陣發(fā)性睡眠