鏈霉素發(fā)酵工藝驗證方案

1、鏈霉素發(fā)酵工藝驗證方案目的：確認鏈霉素發(fā)酵系統(tǒng)工藝流程，確認種子工藝、小小罐工藝、小罐工藝、中罐工藝、大罐發(fā)酵工藝，驗證該發(fā)酵系統(tǒng)工藝的穩(wěn)定性和牢靠性及制備 的發(fā)酵液能否到達中間體規(guī)格要求。范圍：50驗證地點：403驗證對象：原斜面代 、代 斜面12母瓶子瓶小小罐小罐中罐大罐驗證步驟：確定驗證方案，確定驗證打算，內(nèi)容、步驟，以便準確驗證鏈霉素發(fā)酵系統(tǒng)。驗證措施概要：生產(chǎn)記錄：原斜面：冷藏期10外觀無菌外觀集落:白色飽滿、正常代 或代1142外觀無菌外觀集落：白色飽滿、正常母瓶：無菌斜面及外觀無菌菌絲粘稠、色澤米黃、無顆粒狀菌絲681700u/ml963500u/ml 6700u/ml冷藏期5菌

2、絲IIIII子瓶：無菌斜面及外觀無菌菌絲粘稠、色澤米黃、無顆粒狀菌絲120小時7000u/ml144 小時7500u/ml冷藏期7 天 菌絲IIIII小小罐：菌絲IIIII鏡檢無菌PH7.5小罐：菌絲IIIII鏡檢無菌1200u/m3.5g/100m PH7.5中罐：菌絲IIIII鏡檢無菌1800u/m3.5g/100m PH7.5大罐：放罐殘?zhí)?.0 克/100毫升放罐殘氮120毫克/100毫升放罐透光度40%放罐效價14000u/ml原材料：生產(chǎn)過程中所用的各種原材料及其規(guī)格見原材料一覽表設(shè)備：生產(chǎn)鏈霉素所及設(shè)備見設(shè)備一覽表。以上所及設(shè)備的每一局部，必需在本次驗證前確保經(jīng)過適當鑒定IQ/O

3、，并且任何相關(guān)的測試裝置經(jīng)過校正。人員培訓，作為驗證爭辯的一局部，涉及生產(chǎn)鏈霉素發(fā)酵的每位職工均經(jīng)GMP及有關(guān)崗位SOP培訓。生產(chǎn)程序和流程表：生產(chǎn)過程的描述：我廠用于生物合成鏈霉素的生產(chǎn)菌種為灰色鏈霉菌，為了保持菌種的24冰庫內(nèi)，或者將孢子制成牛奶懸濁液，密閉冷藏于196液氮中。每年對生產(chǎn)菌株進展兩次自然分別，把握菌落變異率5%，并進展菌絲八代遺傳穩(wěn)定性考察，考察其母、子代謝及效價單位的穩(wěn)定性。挖取清潔海灘細沙不能污染各種有機物100 吸盡砂內(nèi)鐵屑備用，挖取郊區(qū)地面二尺深處的黃土不能污染各種有機物120 目篩子過篩,用磁鐵充分吸盡土內(nèi)鐵屑備用。以上處理的砂和土，按土一份，砂二份比例混合，分裝

4、于玻璃試管12100m，每支裝1g，用紗布棉塞塞緊置于小銅線筐中，放消毒鍋消毒，間歇滅菌三次，每次壓力0.12MP122111 120、45 小時，外說明批號、日期備用，使用前為確保無菌起見，應按以上要求再消毒烘干一次。取符合質(zhì)量要求的孢子斜面一支，在無菌操作下,參加 0.85%氯化1ml 1#棒將外表孢子輕輕刮下防止用力過重劃破瓊脂1ml 割頭無菌吸管吸出，準確認真地在每支無菌空白砂土管內(nèi)加 0.1ml 孢子液參加時應留意將吸管伸至接近沙土處，但又不能接觸沙土，也不能使吸管口接觸沙土管口及內(nèi)壁。塞緊棉塞，將沙土敲松攤開，放在真空枯燥器內(nèi)枯燥器內(nèi)放置氯化鈣枯燥劑0.10MPa4 4 5 支或以

5、上時，抽干時間酌情增加，取出抽干的沙土孢子，敲松放在盛有無水24冰庫中保存?zhèn)溆?。使用時承受2 年。市售穎牛奶離心三次，3000rpm,15分鐘棄去上層脂肪,將脫脂牛 分鐘消毒。121，60 分鐘，間隙滅菌三次，待用。2#棒輕輕將孢子刮下，用無菌吸管吸孢子牛奶懸濁液置滅菌珠子瓶，10 分鐘,1ml 無菌吸管將珠子瓶內(nèi)的孢子牛奶懸濁液參加無菌安培管中，0.3ml/5年。100 級，每三個月對塵埃粒子0.5u 的塵埃3.5 /1L空氣、風速0.35m/、無菌定點開啟雙碟分鐘1 個/碟進展測定。尋常每次操作定點放置定點開啟雙碟30 分鐘，把握雜菌菌落1 個/碟。每天用前紫外光消毒一小時，每三個月調(diào)換消

6、毒劑1/600潔爾滅、75%酒精。孢子斜面：取生產(chǎn)用之孢子沙土管或孢子冷凍管在無菌室內(nèi)，用操作棒勺取適量27167 天，該生長成之孢子斜面稱為原斜面，僅作孢子傳代使用，不能制備母瓶，液氮冷凍孢子接出原斜面。依據(jù)質(zhì)量2410 天。斜面外觀除了個別不正常集落以外，應大部份為白色，飽滿梅花型， 饅頭型、圓型之集落，將原斜面孢子，選擇23 只正常集落點種第一代，用第一代傳代斜面同樣點種其次代傳代斜面，第一其次代孢子斜27l67 天，第一、其次代斜面14 天，均可制作母瓶，孢子斜面?zhèn)鞯狡浯未鸀橹梗辉賯鞯谌?，挖塊制作過母瓶之剩余孢子斜面，應保存在冷藏庫中一個月，以備檢用。斜面培育基配制法：名稱配比 %

7、葡萄糖注射用0.81.2蛋白胨0.30.6氯化鈉0.40.6豌豆浸出液1216瓊脂海燕牌2.02.8pH7.07.4C (g/100ml)C (g/100ml)N (mg/100ml)P (ug/ml)pH0.9-1.232-3860-906.8-7.5豌豆浸出液制備：豌 豆： 30 克氯 仿： 0.5%二次1000ml1M H SO ：調(diào)pH用2430 克豌豆洗凈瀝干，參加1000ml1M H SO pH至244.50.5蓋緊放置于 371MH2SO4 調(diào)整PH 值維持在 4.24.50.5%371 6 天，粗濾20 去除氯仿750ml 搖瓶中，每瓶裝量約200ml0.09Mpa、11812

8、020分鐘，冷卻后放入冰箱中備用。同時抽樣送化驗，檢驗質(zhì)量，在使用該批豌豆浸出液時，必需再送一次樣品，測定氨氮含量與第一次相接近時可按后一次樣含量計算使用，如其次次含量與第一次不符，須再抽樣復試，以最終一次化驗數(shù)據(jù)為準進展計算使用。豌豆浸出液質(zhì)量：工程工程外觀氨氮NH -N24無菌狀況磷(PO )規(guī)格澄清液170200mg/100ml600ug/100ml左右無雜菌4.1.4母瓶：用符合質(zhì)量標準的同支孢子斜面冷藏期不超過14 天在無菌室內(nèi)用挖塊法分別將孢子接種到已預備好之二只搖瓶中，編號為母I 母 II， 接種后送至溫度 27l23020r mm搖瓶機上，5064II 一IIII 用牛皮紙包扎

9、存放于24II 連續(xù)培育作質(zhì)量檢查，做無菌試驗二支，分別進展2737培育。68 PH、uml24 小時取一次樣測定上述工程，共計三次68 小時， 96 小時，120小時三次如母瓶質(zhì)量符合要求，則母瓶可以進罐使用，5 天。制得的母瓶應菌絲稠粘，目檢無菌絲團顆粒、米黃色、無異味不化稀無菌正常。效價：120 小時6700uml。接子瓶的母瓶制備法，用無菌操作挖一塊斜面，接入一只母瓶，在搖瓶5064 顆粒狀菌絲的母瓶，作為接子瓶用，接種子瓶的母瓶不冷藏。遇特別5天。母瓶原材料及配比方下：原材料葡萄糖配比%3.55.5黃豆餅粉碳酸鈣硫酸銨3.04.50.50.80.50.8氯化鈉磷酸二氫鉀0.250.5

10、0.040.07消后質(zhì)量規(guī)格：CC(g/ml)N(mg/100ml)P(ug/100ml)3.84.8130155130155子瓶：取符合種子質(zhì)量標準之母瓶，在無菌操作條件下，用吸管接入已預備吸管做無菌試驗斜面一支，在37恒溫室培育，接種后子瓶送 27l3044 IIIII 初，長好后，留120 144 小時分別取樣測定效價，一瓶測粘度及氨氮，一瓶接無菌斜面二支作無菌試驗分別培育于273恒溫室及觀看菌絲形態(tài)菌株要加測C及P247 天，如在保存期間覺察有化稀現(xiàn)象或有染菌嫌疑，即停頓使用，改用其他批號種子，放搖23 批瓶存?zhèn)溆?。制得的子瓶應菌絲稠粘，目檢無菌絲團顆粒，米黃色，無異味。不化 子瓶原材

11、料及配比方下：原材料配比%葡萄糖3.55.5黃豆餅粉2.33.5碳酸鈣0.20.7硫酸銨0.50.7氯化鈉00.2磷酸二氫鉀0.0450.07豆油1L玉米漿00.2消后質(zhì)量規(guī)格：N(mg/100ml)160180P(ug/100ml)155180C(g/ml)C(g/ml)6.04.8在某罐種子移植到下一級罐后，進展罐內(nèi)的沖洗及閥墊的更換檢查嚴密度，檢查局部包括空氣分布管，攪拌軸封，與罐相連之法蘭焊接及15 分鐘并檢查過濾器有無培育基倒流。培育基實行實消：0.160.19MPa 進展投料實消。先加水至攪拌處，然后投入已配好的培育基，攪拌成勻漿0.070.12MPa 時20 115124，完畢后

12、保壓冷卻待接種，取消后樣測定C、N、P、PH。28 0.1m3小時流0.5m323 只小罐作種子用。接4 8 PH C 和效價，25 8 NII III 初階2 小時須將種液涂片鏡檢什菌狀況，培育條件：271，35030rmin，4668h，0.5m3/分，假設(shè)種子罐生長過程中pH 量，調(diào)整配方等工藝調(diào)整措施，以期使各級種子罐質(zhì)量符合種子質(zhì)量要求。小小罐原材料及配比方下：原材料名稱葡萄糖 黃豆餅粉硫酸銨 碳酸鈣小小罐120L配比3.55.52.53.50.50.70.20.7小小罐(500L)配比磷酸二氫鉀玉米漿0.0450.070.10.2(機動)豆油1L/罐批氯化鈉配料體積100L0.10

13、.2250L消后體積100L250L消后規(guī)格如下小小罐小小罐pH6.08.0C2.84.4N115170P120200小小罐把握規(guī)格：消后CNP 必需符合質(zhì)量要求，假設(shè)不符合則重投料、消毒。中間把握溫度必需在271，超過30時間較長則不能作為種子。染菌罐不能作種子用。氨氮在中間代謝中必需漸漸利用，假設(shè)后期上升則不作種子用。5放罐把握：殘?zhí)?.5g/100ml，殘氮140mg/100ml，PH7.5，效價800uml。IIIII 初為主。2 3 瓶以上。小罐：在某罐種子移植到下一級罐后，進展罐內(nèi)的沖洗及閥墊的更換，檢查嚴密度，檢查局部包括空氣分布管，攪拌軸封，與罐相連之法蘭焊接15 分鐘并檢查過

14、濾器有無培育基倒流。培育基實行連消：經(jīng)清洗，檢查嚴密后的罐批方可進展空消，空消時0.160.19MPa 時，排出罐內(nèi)冷凝水后再開頭計算4045 1251300.080.1MPa 時導入無菌空氣保壓，即可進入連消狀態(tài)。連消時總蒸汽壓力不低于 0.25MPa，按生產(chǎn)進度把各類罐空消完畢， 0.20.25MPa，45 分鐘后可進入連消連消時通過泵把培育基輸入消毒維持罐0.2MPa，126135、56噸h。消入罐中，冷卻培育基至近培育溫度，保壓待接種，取消后樣測C、N、P、PH。0.160.19MPa 壓力跌 0MPa 進展投料實消。則先加水至攪拌處，然后投入已配好的培育基，攪拌成勻漿狀加熱。翻開各支

15、路蒸汽，關(guān)閉罐蓋待壓力上升0.070.12MPa2025分鐘，消毒溫度為115124，完畢后保壓冷卻待接種，取消后樣測定C、N、P、PH。0.2m3分，5 lm3分，一只小罐種子通常移入一只中罐，特別狀況時一只小罐種子可移入二只中罐。4 8 PH C 和效價，25 8 小時測N，種子罐移種標準菌絲呈IIIII 初階2 小時須將種液涂片鏡檢什菌狀況，培育條件：271，33020rmin，4060h，1m3/分。假設(shè)種子罐生長過程中遇代謝過快時可適時降溫培育，遇代謝慢種子罐PH 上升，可削減通氣量，小罐原材料及配比方下：原材料名稱原材料名稱小罐(500L)配比葡萄糖4.55.5黃豆餅粉2.53.5

16、硫酸銨0.50.7碳酸鈣0.20.7磷酸二氫鉀0.050.07玉米漿0.10.2(機動)豆油1L/罐批氯化鈉0.10.2配料體積250L消后體積250L消后質(zhì)量規(guī)格如下：小 罐小 罐pH6.08.0C3.55.5N120180P130190小罐把握規(guī)格：消后P必需符合質(zhì)量要求，假設(shè)不符合指差距較大接種前必需訂正。271。染菌罐不能作種子用。4放罐把握：殘?zhí)?.5g/100ml，殘氮140mg/100ml，PH7.5，效價1200uml。IIIII 4048 小時。中間代謝中，氨氮必需逐步利用。2 只小罐。一只小小罐可全部接入中罐作種子用。中罐：在某罐種子移植到下一級罐后，進展罐內(nèi)的沖洗及閥墊的

17、更換，檢查嚴密度，檢查局部包括空氣分布管，攪拌軸封，與罐相連之法蘭焊接及閥門等，如15 分鐘并檢查過濾器有無培育基倒流。0.160.19MPa 時，排出罐內(nèi)冷凝水后再開頭計算4045 125130罐壓維持在 0.080.1MPa 時導入無菌空氣保壓，即可進入連消狀態(tài)。連消時總蒸汽壓力不低于 0.25MPa， 按生產(chǎn)進度把各類罐空消完畢，同時各所用管路也必需經(jīng)蒸汽消毒，壓力 0.20.25MPa，45 分鐘后可進入連消，連消時通過泵把培育基輸入消毒維持罐，連消條件為0.2MPa，126135、56 噸h。消入罐中，冷卻培育基至近培育溫度，保壓待接種，取消后樣測C、N、P、PH。中罐由小罐移入種子

18、或整只小小罐移入，開頭加空氣流量，前5 小360m3h，每二只中罐可移入一只大罐。各級罐壓出種子前均先用被接種罐內(nèi)培育基壓到壓出罐接種管進展冷卻管道，防止燙傷種子。4 8 PH C 和效價，25 8 小時測N，種子罐移種標準菌絲呈IIIII 初階2 小時須將種子液涂片鏡檢什菌狀況。培育條件：271，18020rmin，3560h，6 m3/分，假設(shè)種子罐生PH 削減通氣量，調(diào)整配方等工藝調(diào)整措施，以期使各級種子罐質(zhì)量符合種子質(zhì)量要求。原材料葡萄糖原材料葡萄糖 黃豆餅粉硫酸銨 氯化鈉 碳酸鈣 玉米漿 豆油硫酸二氫鉀配料體積消后體積配比%4.55.52.53.50.50.70.102(機動)0.2

19、0.70.10.2(機動)8L/罐0.050.073.23.5M3.03.2M消后質(zhì)量規(guī)格如下：PHPH消 后 C消后N消后 P6.08.0(g/100ml)3.55.5(mg/100ml)120180(r/l)130190中罐把握規(guī)格：CNP 必需符合質(zhì)量要求，假設(shè)不符合指差距較大在接種前必需實行措施訂正。中間把握溫度必需在271，超過30時間較長則不能作為種子用。染菌罐不能作種子用。氨氮在中間代謝中必需漸漸利用。菌齡必需以把握菌絲階段IIIII 3050 小時。接種量一只小罐接一只中罐，或一只小小罐可接一只中罐。7放罐把握：殘?zhí)?.5g/100ml，殘氮140mg/100ml，PH7.5，

20、效價1800uml。8小小罐、小罐、中罐遇到氨氮消耗快時可將罐溫調(diào)整到26 0. 5培育。大罐：大罐放罐后，降罐壓至零磅，開蓋用水沖洗，將沖洗后的殘留發(fā)酵液，壓入提煉承接桶內(nèi)，再翻開罐蓋，進罐內(nèi)去除積垢后，檢查攪拌，空 氣分布管，葉子及上下婆司是否松，同時進展閥墊及填料的更換和檢 修工作。然后蓋好罐蓋，通入空氣，進展各連接處法蘭等、閥門、配 根、罐蓋、氨水、空氣等嚴密度檢查。待檢查完畢后，蓋緊罐蓋、準 備下次空罐消毒。如遇染菌，可下去敲鏟，去除積垢，空消時延長消 30 分鐘。罐空消：0.160.19MPa 進展壓水后進展45 0.080.1MPa 保壓，假設(shè)上一罐批染菌，則金屬過濾器進展消毒。

21、發(fā)酵罐培育基消毒：0.3MPa，用泵將已配制的氮源餅粉等碳源糖水依次分別進入消毒塔、維持罐消0.2MPa58分鐘。 2 噸自來水，最終可酌情消入自來水補足體積。發(fā)酵罐原材料及配比方下：原材料原材料黃豆餅粉葡萄糖硫酸銨配比1.82.24.06.00.20.7氯化鈉碳酸鈣 磷酸二氫鉀豆油 玉米漿 氯化鈷 配料體積消后體積00.20.20.70.060.091030L0.10.20.23440M2537M消后質(zhì)量規(guī)格如下：pHC(g/100ml)大于6.24.56.5消后 N (mg/100ml)130160消后 P(r/ml) 2002603040M378分鐘后，004006MPa，開啟入罐閥接入

22、培育基，當培育基遇到蛇形管、即開冷卻水冷卻。當接料完畢，關(guān)閉入罐閥，進空氣，保持罐壓 008009MPa，待溫度冷至29預備接種。消后測PH要求 62 以上，如低則加NaOH 調(diào)整。接種前、接種后取樣測C、N、P、PH并做無菌測驗。發(fā)酵罐大罐接種和培育，發(fā)酵工藝。發(fā)酵罐接種：01MPa 以上，保持發(fā)酵罐之0.030.05MPa，翻開接種入罐閥，種子罐中罐或倒動身酵罐菌液借壓力差流入發(fā)酵大罐內(nèi)，接完后關(guān)罐入罐閥，開入適量空氣流量在 10m3分以上，保持罐壓先將罐內(nèi)培育基壓到壓出種子罐接種管道進展管道冷卻，防止燙傷種子。發(fā)酵罐培育和工藝接種：發(fā)酵大罐由2348110hr35t。各級罐壓出種子前均先

23、用被接種罐罐內(nèi)培育基壓到接種罐進展冷卻管道，防止燙傷種子。IIIII2液涂片鏡檢什菌狀況.培育條件罐溫:2630，一般把握在29，罐溫測定用電阻溫度計量來2527培育，后期代謝慢的罐批30培育數(shù)小時至放罐。罐壓:?？諝饬髁?10m分以上，不開攪拌，以后逐級增加流2530m/4555。如遇發(fā)酵后期反響劇烈，可適當降低空氣流量和提高罐壓。攪拌轉(zhuǎn)速:大罐正常轉(zhuǎn)速在 110120rmin，亦可依據(jù)生長代謝進展調(diào)速。前期70時，攪拌全開，中后期攪拌全開。培育時間:16010中間取樣:8214pH，2010081002440814000uml，透光度40%。發(fā)酵大罐中間把握消沫：前期或后期發(fā)酵猛烈時可少量

24、屢次加油，中期由于補糖量增加液面上升也可酌情加油，假設(shè)加油無效可放提煉假設(shè)干噸。補糖：30504060，203046反常罐可酌情減量補入。第一次把握殘?zhí)呛咳狈Σ糠萏砑又?.85.2%其次次把握殘?zhí)呛?.85.0%第三次把握殘?zhí)呛?.04.5%第四次把握殘?zhí)呛?.52.8%第五次把握殘?zhí)呛?.72.0%特別狀況一次補糖量3.0時以分二次補入為宜，第三、四、五次補0.5則第五次糖可以不補。后期把握補糖量應與氮耗相調(diào)，防止發(fā)酵液化稀。補氮：補氮可用15的無菌過濾氨水或NHSO4241依據(jù)殘氮用量計算通氨量參考控氮水平。3參考代謝及濃度。204035l35l次通氨為流加，生長期最適pH6.56.9，氨氮水平可在90120mg100m40PH把握在6.87.，80100mg100mlpH7.10NHSO424替氨水，以調(diào)低 pH SO0.l20mg100ml NHN。硫4242酸氨把握補入量0.11401207585mg10