慢性冬眠心肌其中的間質(zhì)重塑

1、慢性冬眠心肌其中的間質(zhì)重塑【摘要】目的：觀察慢性冬眠心肌h間質(zhì)變化及其對心功能的影響。方法：對小型豬采用球囊擴張及內(nèi)膜剝脫術(shù)，造成心臟左前降支中段狹窄、心肌慢性缺血，建立h模型。24只小型豬被分成：h組和假手術(shù)組，于模型建立后4周、12周終止實驗。心臟切片以he染色，透射電鏡觀察組織形態(tài)學(xué)；以苦味酸天狼星紅(psr)染色，偏光鏡觀察間質(zhì)膠原纖維類型和比例；以免疫組化法測定間質(zhì)糖蛋白、纖維結(jié)合蛋白fn和骨橋蛋白pn；以超聲心動圖觀察左室收縮功能。結(jié)果：較之假手術(shù)組1h的間質(zhì)空間擴大，成纖維細胞增多，膠原增生；2h的間質(zhì)膠原容積分數(shù)ivf、血管周圍膠原容積分數(shù)pvf及光密度積分id、fn和pn均明

2、顯增加，并隨時間延長而增加(p0.01)；3psr染色偏光鏡觀察示h組型膠原大量聚集，排列紊亂，型膠原少量，/膠原比例增高；4h組的左室射血分數(shù)lvef、左室短軸縮短率lvfs、室壁增厚率%t顯著降低(p0.01)；5膠原纖維含量與lvfs、lvef和%t呈高度負相關(guān)(r=-0.754-0.872，p0.01)。結(jié)論：慢性冬眠心肌出現(xiàn)間質(zhì)重塑。【關(guān)鍵詞】冠狀動脈疾??；心肌頓抑；纖維膠原類；糖蛋白類；心室重構(gòu)authrsaddress：departentfardilgy,pepleshspitalffujianprvine,fuzhu,fujian,350007,hinakeyrds：rnary

3、arterydisease;yardialstunning;fibrillarllagens;glyprteins;ventriularredeling慢性冬眠心肌h廣泛存在于心絞痛、心肌堵塞以及不明原因的左室功能不全患者中1，2。以往對冬眠心肌的研究大多著眼于心肌本質(zhì),而對心肌間質(zhì)的形態(tài)改變及其病理生理意義關(guān)注較少，本研究旨在討論小型豬慢性冬眠心肌間質(zhì)變化及其對心功能的影響。1資料與方法1.1動物分組槐豬24只，雄性，月齡57個月,體重2535kg購自福建上杭國家級槐豬保種場，被隨機分為4組，h4周組：6只動物，自心肌冬眠起點繼續(xù)飼養(yǎng)4周；假手術(shù)4周組：6只動物，自假手術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)4周；h1

4、2周組：6只動物，自心肌冬眠起點繼續(xù)飼養(yǎng)12周；假手術(shù)12周組：6只動物，自假手術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)12周。1.2實驗方法1.2.1模型制備：對實驗組槐豬采用球囊冠脈擴張及內(nèi)膜剝脫術(shù)造成冠脈左前降支lad中段狹窄、心肌缺血及慢性心肌冬眠模型。選擇左前降支中段,定量冠狀動脈造影(qa)測定直徑,以球囊血管1.31的比例,球囊壓616at擴張并來回拉3次,每次30s,間隔為1in，形成冠狀動脈損傷。假手術(shù)組只進展冠脈造影，不進展球囊擴張。1.2.2冠狀動脈造影：分別于術(shù)后4周、12周重復(fù)冠狀動脈造影，選擇舒張晚期造影圖像，采用qa技術(shù)定量測量冠狀動脈直徑狹窄率。1.2.3左心室射血分數(shù)lvef、左室短軸縮

5、短率lvfs、室壁增厚率%t：分別于術(shù)后2h、4周、12周進展超聲心動圖檢測。詳細如下：取乳狀肌程度左心室短軸切面圖像，應(yīng)用型超聲心動圖連續(xù)測量3個不同心動周期，每個測值均為三次測值的平均值。采用計算機輔助收縮功能定量分析法進展%t計算，%t=(ths-thd)/thd100%,其中ths、thd分別代表收縮末期及舒張末期室壁厚度。1.2.4室壁運動分析1靜息室壁運動分析：按照美國超聲協(xié)會左心室16節(jié)段劃分法，以目測半定量法評估lad供血區(qū)室壁運動情況(14分):1分為運動正常；2分為運動減弱；3分為運動消失；4分為矛盾運動。計算室壁運動積分指數(shù)(si)，si=各節(jié)段記分之和/總節(jié)段數(shù),正常為

6、1；2腺苷負荷超聲心動圖試驗ase：室壁運動分析3在心電監(jiān)測下,先以腺苷100g/kgin靜脈連續(xù)推注、持續(xù)5in；假設(shè)未檢出部分心室壁收縮功能變化，繼以最大劑量200g/kgin靜脈連續(xù)推注、持續(xù)5in。室壁收縮功能變化的類型分為：持續(xù)改善：代表非心肌缺血；雙相反響：代表存活的冬眠心??；無變化：代表不存活的壞死心跡1.2.5光鏡觀察：所有心臟標本從心尖起，垂直左心室長軸切成5薄片，取lad所支配的左室前壁(避開局灶性心肌堵塞部位)和正常心肌組織，二者都包括心內(nèi)膜至心外膜的全層心肌，按常規(guī)石蠟包埋后，每個組織塊做連續(xù)5切片。he染色及苦味酸天狼星紅psr染色4。1.2.6透射電鏡觀察：在灌注中

7、性甲醛溶液前分別取假手術(shù)組和h組術(shù)后4周、12周的心室組織13大小各一份，以3%戊二醛、1.5%多聚甲醛、0.1磷酸鹽緩沖液pbs，ph7.2)于4作前固定，3d后送福建醫(yī)科大學(xué)電鏡室，經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛染色制片后在日立hu-12a型透射電鏡下觀察。1.2.7膠原面積、含量光密度：定量分析psr染色切片，光鏡下放大100倍，取心肌組織及血管周圍組織(避開心外膜下區(qū)域，測定膠原面積所占視野總面積的百分比ivf、pvf，隨機計算10個視野，而后取平均值，同時測定同一視野下平均光密度積分(id)，代表膠原含量。1.3統(tǒng)計學(xué)處理所有實驗數(shù)據(jù)以均值標準差(s)表示，用spss11.5統(tǒng)計軟件進展分析，組

8、間比擬采用單因素方差分析，兩變量間的相關(guān)分析采用線性相關(guān)。p0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1一般情況14只豬參與冬眠模型組制作，除1只術(shù)中死于心室顫抖、另1只術(shù)中死于心包填塞外，其余12只豬均順利完成了所有實驗步驟，其中5只豬出現(xiàn)病變中心小灶性心肌壞死(h4周組2只，h12周組3只)。h4周組和h12周組各6只符合慢性冬眠心肌標準。假手術(shù)對照組所有動物無死亡及心肌壞死。2.2冠狀動脈狹窄程度在實驗完畢時，qa法測量h4周及h12周組的冠狀動脈直徑狹窄率分別為906%及934%。對照組動物冠狀動脈造影未見狹窄。2.3超聲心動圖室壁運動分析靜息時，假手術(shù)組無室壁運動障礙，h4周和h12周組la

9、d供血區(qū)域有不同程度室壁運動障礙情況見表1；ase時，h4周、h12周組lad供血區(qū)域室壁運動障礙情況及其變化見表2。表1各組小型豬靜息超聲心動圖室壁運動障礙程度及節(jié)段數(shù)比擬注：h慢性冬眠心跡各組動物數(shù)均為6只，按ase的16節(jié)段劃分法左心室節(jié)段數(shù)量均為96下表同。與假手術(shù)組比擬p0.01；與h4周組比擬p0.01。表2腺苷負荷超聲心動圖試驗ase室壁運動障礙程度及節(jié)段數(shù)比擬注：與假手術(shù)組比擬p0.05。2.4光鏡與電鏡觀察假手術(shù)組心肌構(gòu)造無明顯異常。h4周組心肌纖維數(shù)量減少，走向不規(guī)那么，細胞變性、水腫、灶性壞死，間質(zhì)中膠原增生；電鏡下局灶性肌絲斷裂、溶解，肌節(jié)紊亂，線粒體腫脹、嵴紊亂、斷裂

10、，肌漿網(wǎng)擴張，核周空區(qū)增大；成纖維細胞增生，核大、高爾基器興旺,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張,內(nèi)充滿有形物質(zhì)。h12周組病變更為明顯，肌纖維斷裂溶解，部分細胞萎縮，間質(zhì)空間擴大，大量膠原增生，呈柵欄狀包裹心肌細胞；電鏡下肌絲肌節(jié)紊亂，肌原纖維脫失，大量小線粒體，t管減少，核畸形，膠原含量明顯增多，部分呈束狀或網(wǎng)狀分布。2.5psr染色偏振光顯微鏡下觀察h組有黃紅色雙折光型膠原大量聚集,排列紊亂,有少量綠色弱雙折光型膠原，/膠原比例增高。h12周組心肌型、型膠原均較h4周組更加明顯和廣泛，平行交織紊亂排列，其中以黃紅色型膠原增加最為明顯。2.6膠原面積、含量光密度定量分析與同期的假手術(shù)組比擬，h4周組心肌間質(zhì)組織

11、ivf、pvf及其id均明顯增加；h12周組與h4周組相比，ivf、pvf及其id增加更為顯著(p均0.01)，見表3、4。表3各組小型豬慢性冬眠心肌間質(zhì)膠原纖維含量的變化注：與假手術(shù)組比擬p0.01；與h4組比擬p0.01。下表同。表4各組小型豬慢性冬眠心肌血管周圍膠原纖維含量的變化2.7fn、pn表達陽性率免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，不同時間點h組心肌間質(zhì)組織糖蛋白fn、pn表達程度均顯著增加(p0.01)，其變化呈上升趨勢，即h12周組與h4周組相比有明顯增高(p0.01)，見表5。表5各組小型豬慢性冬眠心肌間質(zhì)糖蛋白含量的變化2.8lvef、lvfs和%t心肌冬眠慢性過程中，

12、心臟的整體和部分收縮功能均呈下降趨勢，表現(xiàn)為h組的lvef、lvfs和%t都比同期的假手術(shù)組顯著降低以及h12周組的lvef、lvfs和%t比h4周組的顯著降低(p均0.01)，見表6。表6各組小型豬慢性冬眠心肌心功能的變化2.9心肌間質(zhì)變化對心功能的影響對心肌間質(zhì)各成分變化與超聲心動圖測量的各項心功能指標進展相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)兩組指標間具有較高程度的負相關(guān)性，見表7。表7各組小型豬慢性冬眠心肌心功能的相關(guān)性分析注：p均0.013討論心肌冬眠是缺血心肌防止壞死的一種自我保護機制，及時血運重建可使冬眠心肌功能恢復(fù)正?；蚪咏?，而延期血運重建不僅使冬眠心肌產(chǎn)生細胞慢性喪失5,6，還可能會發(fā)生心肌間質(zhì)變

13、化。關(guān)于冬眠心肌的產(chǎn)活力制及其結(jié)局是近年的研究熱點7。本研究觀察到：心肌冬眠后間質(zhì)和血管周圍膠原纖維含量明顯增多，并隨時間推移而加重，psr染色顯示型膠原均明顯增生，尤以型膠原大量聚集,排列紊亂,/膠原比例增高。光鏡及電鏡觀察顯示心肌間質(zhì)成纖維細胞增殖，心肌灶性纖維化。提示慢性冬眠心肌存在膠原纖維增生以及膠原類型和比例的改變。心肌膠原網(wǎng)絡(luò)重塑是導(dǎo)致心肌間質(zhì)重塑主要因素，可造成左心室僵硬、舒張功能異常；血管外周纖維化致管壁彈性改變，硬度加大，限制了冠脈舒張，大量膠原蓄積還會影響心肌細胞力的產(chǎn)生和傳遞，收縮功能亦會受損，最終產(chǎn)生心力衰竭。fn為細胞間質(zhì)中的糖蛋白,參與組織的增生、修復(fù)、纖維化。研究

14、說明，在主動脈狹窄所致的心肌肥厚中，fn聚積先于膠原聚積，fn和膠原均參與壓力負荷對心肌損傷的修復(fù)，fn是更敏感指標。在擴張型心肌病患者，fnrna含量較正常人增加2倍8。本研究應(yīng)用免疫組化法觀察fn在h中表達的變化，結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，不同時間點h組間質(zhì)中fn表達程度均顯著增加，其變化呈上升趨勢，說明在心肌冬眠過程中，隨著膠原纖維的大量增生，fn也在心肌間質(zhì)中大量表達。動物實驗說明：心肌損傷后3d，fnrna表達即增多，7d時累積顯著，其作用與損傷修復(fù)有關(guān)，因此我們認為，在h中fn表達增加為慢性低灌注導(dǎo)致心肌細胞受損的結(jié)果，反映了冬眠心肌損傷修復(fù)的過程，但過度表達那么說明間質(zhì)重塑和纖維

15、化。pn由成骨細胞、血管內(nèi)皮細胞等合成并分泌，可通過與整合素家族分子或與d44結(jié)合，激活細胞內(nèi)特異性信號傳導(dǎo)系統(tǒng)而介導(dǎo)細胞粘附、遷移和增殖。pn在醛固酮誘導(dǎo)的心臟重塑中起著重要作用，醛固酮受體拮抗劑防止心肌纖維化部分是通過抑制pn的表達9。本研究觀察到：h間質(zhì)中pn的表達明顯增高，并隨時間延長而增加。franggiannis等6的研究說明另一種基質(zhì)糖蛋白tenasin在慢性冬眠心肌間質(zhì)的表達亦明顯增加，因此可以認為，基質(zhì)糖蛋白表達是慢性冬眠心肌間質(zhì)重塑活潑的有力證據(jù)。同時，我們還觀察到fn和pn在間質(zhì)中的表達隨時間延長而增加，說明間質(zhì)重塑是一進展性開展的過程，提示在臨床上應(yīng)盡早進展血運重建，及

16、時阻斷病變開展。心肌冬眠后可發(fā)生與急性心肌堵塞后類似的心室重塑，表現(xiàn)為lvef、%t下降，左室舒張末期容積lvedv及左室重量增加。冬眠心肌本質(zhì)重塑表現(xiàn)為心肌細胞肥大、變性、左室重量增加以及通過細胞凋亡等使心肌細胞喪失，心肌功能恢復(fù)不全或延遲恢復(fù)10。本研究相關(guān)分析顯示間質(zhì)重塑與心功能呈高度負相關(guān)，說明在心肌冬眠的慢性過程中，心肌間質(zhì)重塑參與了心室重塑發(fā)生，是導(dǎo)致心功能下降的重要因素之一。心室重塑是心臟疾病-終末性心臟病-慢性心衰演變的核心機制之一，因此，有理由認為，冬眠心肌間質(zhì)重塑可能是慢性缺血心肌開展為缺血性心肌并慢性心衰的重要病理生理機制?！緟⒖嘉墨I】1iggersh,nielsenss

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