發(fā)酵批報分析專家(FRAE)使用介紹

1、FRAE 使用手冊 來自發(fā)酵人第 表 1），填寫數(shù)據(jù)，前兩行不能寫數(shù)據(jù)，否則會產(chǎn)生異常。每增加一批數(shù)據(jù)，請插入一個“sheet”，不要有空的sheet.5.5 用戶的報表不要設(shè)置密碼保護(hù)，否則可能會出現(xiàn)異常。表 SEQ 表 * ARABIC 1批記錄格式（以發(fā)酵批報為例）發(fā)酵工藝批報時間pH總糖還 原 糖氨基氮效價生物效價粘度PMV組分B聯(lián)系方式：A、E.mail HYPERLINK mailto: B、或登錄 HYPERLINK 給 網(wǎng)站管理員“細(xì)履平沙”留言C、或向發(fā)行商索要服務(wù)電話。軟件應(yīng)用附一份華東理工大學(xué)碩士論文第三章。這一章中是這一軟件的典型應(yīng)用。應(yīng)用新型分析方法挖掘紅霉素發(fā)酵批報

2、有效信息前言 目前，科研人員在發(fā)酵過程優(yōu)化方面的研究涉及兩方面的工作：實驗和模型。實驗數(shù)據(jù)是模型的基礎(chǔ)，而模型可以使實驗安排得更加合理和可靠，更易于實現(xiàn)過程的最優(yōu)化，因此如何建立模型成為了研究人員關(guān)注的焦點 ADDIN EN.CITE Lee20067717Lee, K. M.Gilmore, D. F.Arkansas State University, Environmental Sciences Program, State University, AR 72467. klee0922yahoo.co.krStatistical experimental design for biopr

3、ocess modeling and optimization analysis: repeated-measures method for dynamic biotechnology processAppl Biochem BiotechnolApplied biochemistry and biotechnologyAppl Biochem BiotechnolApplied biochemistry and biotechnologyAppl Biochem BiotechnolApplied biochemistry and biotechnology101-161352Analysi

4、s of VarianceBioreactorsBiotechnology/*methodsFermentationLipids/biosynthesisModels, BiologicalMultivariate AnalysisResearch Design2006Nov0273-2289 (Print)17159235/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=17159235 engPoirazi20078817Poirazi, P.Leroy, F.Georgalaki, M. D.Aktypis

5、, A.De Vuyst, L.Tsakalidou, E.Laboratory of Dairy Research, Department of Food Science and Technology, Agricultural University of Athens, Iera Odos 75, 118 55 Athens, Greece.Use of artificial neural networks and a gamma-concept-based approach to model growth of and bacteriocin production by Streptoc

6、occus macedonicus ACA-DC 198 under simulated conditions of Kasseri cheese productionAppl Environ MicrobiolApplied and environmental microbiologyAppl Environ MicrobiolAppl Environ MicrobiolApplied and environmental microbiology768-76733AnimalsBacteriocins/*biosynthesisCheese/*microbiologyFermentation

7、Hydrogen-Ion ConcentrationMilk/metabolism/microbiology*Models, Biological*Neural Networks (Computer)Sodium Chloride/pharmacologyStreptococcus/*growth & development/*metabolismTemperature2007Feb0099-2240 (Print)17158625/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=17158625 engZeli

8、c2004323217Zelic, B.Vasic-Racki, D.Wandrey, C.Takors, R.Faculty of Chemical Engineering and Technology, University of Zagreb, Marulicev trg 19, 10000 Zagreb, Croatia. bzelicmarie.fkit.hrModeling of the pyruvate production with Escherichia coli in a fed-batch bioreactorBioprocess Biosyst EngBioproces

9、s and biosystems engineeringBioprocess Biosyst EngBioprocess and biosystems engineeringBioprocess Biosyst EngBioprocess and biosystems engineering249-58264Bioreactors/*microbiologyCell Culture Techniques/*methodsCell ProliferationComputer SimulationEscherichia coli/*physiologyGlucose/*metabolism*Mod

10、els, BiologicalPyruvic Acid/*metabolism2004Jul1615-7591 (Print)15085423/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=15085423 eng于乃功200710310317于乃功阮曉鋼基于細(xì)胞自動機模型的青霉素發(fā)酵過程優(yōu)化控制策略北京工業(yè)大學(xué)學(xué)報北京工業(yè)大學(xué)學(xué)報150-154,1653322007張大鵬200610410417張大鵬 王福利何大闊何建勇桑海峰常玉清基于分時段參數(shù)修正的發(fā)酵模型的建立Chinese Journal of Sci

11、entific InstrumentChinese Journal of Scientific Instrument2712200626-30。目前，生物技術(shù)領(lǐng)域最有代表性的模型用在了同位素標(biāo)記的代謝流計算上，因為該模型計算量大而復(fù)雜，涉及了上千個方程 ADDIN EN.CITE McKinlay2007454517James B. McKinlayYair Shachar-HillbJ. Gregory ZeikusClaire VieillecDetermining Actinobacillus succinogenes metabolic pathways and fluxes by N

12、MR and GC-MS analyses of 13C-labeled metabolic product isotopomersMetabolic EngineeringMetabolic Engineering177192 920071563572016duct isotopomers .pdfNoh2006474717Katharina NohAljoscha WahlWolfgang WiechertComputational tools for isotopically instationary 13C labeling experiments under metabolic st

13、eady state conditionsMetabolic Engineering Metabolic Engineering554-577820061337957440nary 13C labeling.pdf31,32，這些模型為我們深入了解細(xì)胞代謝提供了強大而可靠的工具。但是，這些研究多集中于對過程進(jìn)行模型化，而對大量的發(fā)酵批記錄的數(shù)據(jù)挖掘上研究甚少。目前我國各大型發(fā)酵企業(yè)每天都有多批發(fā)酵過程完成，每批都有大量的過程數(shù)據(jù)，且在現(xiàn)有企業(yè)中大量的有關(guān)生物技術(shù)特性參數(shù)（如糖、氮、磷、菌體量等）是通過離線測定來完成的，因此歷史數(shù)據(jù)量極為龐大。這些蘊藏著豐富信息的數(shù)據(jù)得不到利用或利用不充分，勢必

14、造成很大的浪費，如果能夠從這些數(shù)據(jù)中得到有價值的規(guī)律，將會對發(fā)酵生產(chǎn)的穩(wěn)定和提高起到積極的推動作用。本文以本實驗室王軍峰老師開發(fā)的一種基于數(shù)理統(tǒng)計的發(fā)酵批報集處理新方法來處理以往近100份紅霉素發(fā)酵批報，對數(shù)據(jù)進(jìn)行了處理分析與挖掘，希望得到一些對紅霉素發(fā)酵優(yōu)化研究具有參考價值的信息。3.2 方法和步驟3.2.1 主要步驟根據(jù)軟件要求將批報中所有參數(shù)整理成一個excel文件，文件中每個sheet的列數(shù)據(jù)代表：相應(yīng)參數(shù)按取樣先后排序的數(shù)值，這里稱為“列向量”，然后用軟件處理這個文件得到有關(guān)參數(shù)與發(fā)酵結(jié)果的相關(guān)性，同時提取出能顯著提高發(fā)酵結(jié)果的參數(shù)值范圍，這些范圍，在較大的置信概率下，構(gòu)成了提高生產(chǎn)

15、效率的工藝調(diào)控策略。研究表明該方法可為科研提供有價值的線索，能夠在計算機的輔助下快速完成對大量歷史批報的數(shù)據(jù)挖掘工作。數(shù)據(jù)處理方法略3.3 應(yīng)用批報處理軟件對發(fā)酵過程參數(shù)的處理和分析首先將80份工業(yè)生產(chǎn)的紅霉素的批記錄(60t發(fā)酵罐)，按照相同的格式，集中到一個excel文件中，每張表(sheet)代表一個發(fā)酵批次的數(shù)據(jù)。表中第一列代表從小到大排序的時間列向量，之后是按照時間排序的pH、總糖、氨基氮、粘度、效價、補糖、補油、補醇列向量(見表1之表頭所示)。然后用FRAE軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。發(fā)酵過程各時刻參數(shù)對效價影響圖3.1 發(fā)酵過程各時刻參數(shù)對效價影響的經(jīng)驗值i,j概貌Fig 3.1 Gen

16、eral picture of the experience value i,j of the various times parameters on the impact of titer in fermentation process圖3.1中顏色越深表示相關(guān)性越強，深色方塊多集中在第7個取樣點之前，說明各個因素對發(fā)酵單位的影響發(fā)生在前期。表3.1 發(fā)酵過程各時刻的參數(shù)對發(fā)酵單位影響的經(jīng)驗值i,jTab 3.1 The experience value i,j of the various times parameters on the impact of titer in ferment

17、ation process進(jìn)行紅霉素工藝優(yōu)化的主要目的是提高效價。本文計算了所有發(fā)酵過程參數(shù)對效價的影響值。表3.1表明48小時之前pH、64小時之前的總糖、848小時氨基氮、840小時粘度、48小時的起始效價、40小時之前的補油以及2448小時的補醇等這些時間段相關(guān)參數(shù)的變化對最終效價有顯著影響。從時間上看，對效價有顯著影響的點集中在前期，因此可以初步推定：影響紅霉素最終效價的關(guān)鍵因素作用在前期，而pH、總糖、氨基氮、粘度、起始效價是這些關(guān)鍵因素的表現(xiàn)形式。 表3.1第7行第5列代表起始效價對最終效價影響的經(jīng)驗值是144。圖3.2說明起步效價對發(fā)酵結(jié)果的影響很明顯，起步效價高，則最終效價高，

18、得出這一結(jié)論的置信概率為95%(軟件界面中有提示)，這也是對“影響紅霉素最終效價的因素作用發(fā)生在前期”這一結(jié)論的一個有力支持。圖3.2 起始效價高低對應(yīng)發(fā)酵過程各時刻效價的均值及兩組效價差異的置信概率Fig 3.2 The various times average titer of fermentation process corresponding start titer發(fā)酵過程參數(shù)優(yōu)化該程序可以統(tǒng)計出各個參數(shù)對發(fā)酵單位影響的經(jīng)驗值，同時也能自動的根據(jù)高單位批次與低單位批次之間的差異，計算出所有參數(shù)的理想控制范圍，這樣就形成了發(fā)酵過程參數(shù)的控制策略，從而指導(dǎo)發(fā)酵過程的工藝控制。pH的控制從

19、圖3.3可以看到高單位批次與低單位批次在pH控制范圍上的差異：高單位罐批次前期pH上升高且早、后期也比低單位罐批的pH控制要高。工藝要求在發(fā)酵中后期將pH控制到6.67.2范圍內(nèi)，從圖3.3可以看出在48小時之后，將pH控制到6.97.1之間更適合紅霉素的生物合成，這與前人的研究結(jié)果一致，也證實了FRAE的統(tǒng)計結(jié)果的合理性。pH是菌體與培養(yǎng)基綜合作用的結(jié)果，pH變化迅速說明菌體代謝旺盛，從圖3.6可以發(fā)現(xiàn)這一階段高單位批次的粘度高于低單位批次。說明在前期菌體生長快，將有利于后期的抗生素的合成。圖3.3 高單位批次罐(深色)和低單位批次罐(淺色)的pH差異 Fig 3.3 The pH diff

20、erence of high titer batch(dark) and low titer batch(light)總糖的控制從圖3.4總糖范圍曲線變化可看到：高單位批次起步總糖值高于低單位批次。整個過程，高單位批次的糖代謝速率明顯要快于低單位批次的罐批。調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中糖代謝速率很難實現(xiàn)，但是初始的總糖濃度是可控制的。根據(jù)以上情況，我們推測在紅霉素初始發(fā)酵培養(yǎng)基中增加糖濃度可能會提高發(fā)酵單位。在第5章中驗證了這個推測。圖3.4 高單位批次罐(深色)和低單位批次罐(淺色)的總糖差異 Fig 3.4 The total sugar difference of high titer batch(d

21、ark) and low titer batch(light)氨基氮的控制通過氨基氮范圍曲線變化可看出與總糖曲線變化很相似：也表現(xiàn)出了初始氮基氮高，則代謝好的趨勢。這就給了我們一個提示，在現(xiàn)有的設(shè)備條件下，前期氮源豐富可能更利于提高發(fā)酵單位，而要達(dá)到這一目的，一方面可以通過盡量減少消毒過程的損耗，另一方面可以增大營養(yǎng)物質(zhì)配比，也可以減少接種量（本實驗室已經(jīng)將50L罐接種量從10%降到4%，發(fā)酵單位比之前有小幅提高）。通過圖3.4和圖3.5 可以推測出在被統(tǒng)計的發(fā)酵批報情況下發(fā)酵配方的C和N源有些偏少，有進(jìn)一步優(yōu)化的需求。圖3.5 高單位批次罐(深色)和低單位批次罐(淺色)的氨基氮差異 Fig

22、3.5 The amino nitrogen difference of high titer batch(dark) and low titer batch(light) 粘度的控制圖3.6 高單位批次罐(深色)和低單位批次罐(淺色)的粘度差異 Fig 3.6 The viscosity difference of high titer batch(dark) and low titer batch(light)從圖3.6可以清楚的看到了，在前期和后期粘度大的批次發(fā)酵單位高。在生物發(fā)酵過程中，發(fā)酵液流變學(xué)特性對微生物發(fā)酵的影響至關(guān)重要。通過控制發(fā)酵液的黏度可以使細(xì)胞的濃度達(dá)到最大。不同微生物

23、細(xì)胞濃度對發(fā)酵液粘度的影響是不同的，這主要取決于微生物的細(xì)胞形態(tài)，含有菌絲體液體培養(yǎng)基的粘度要顯著高于含有球形酵母或細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)基的粘度。在較低的濃度下，發(fā)酵液的粘度與微生物細(xì)胞的濃度近似地呈比例關(guān)系，但若細(xì)胞濃度較高，則粘度迅速增大。同時紅霉素又是一個發(fā)酵過程耗氧較大的產(chǎn)品，因此在大型生物反應(yīng)器的設(shè)計，往往從工程角度考慮來滿足其需求，目前最常用的方法即為：配備較高功率的電機（2 kw/m3以上）、配備具有全釜混合功能的軸向流攪拌、通入足夠量的空氣等；另一方面，單從工程角度考慮投入大，生產(chǎn)操作成本提高，同時也可能會產(chǎn)生氣泛、氣溶膠現(xiàn)象等嚴(yán)重影響供氧的副作用；且在真正的生產(chǎn)過程中若不能滿足細(xì)胞代

24、謝特性的需求，則會導(dǎo)致產(chǎn)品生產(chǎn)的失敗。因此紅霉素發(fā)酵過程既要維持較高的菌濃，又要保證供氧的需要，就需要維持發(fā)酵液粘度在一個合理的范圍內(nèi)(見圖3.6)。 補糖的控制圖3.7 高單位批次罐(深色)和低單位批次罐(淺色)的補糖差異 Fig 3.7 The addition difference of sugar of high titer batch(dark) and low titer batch(light)根據(jù)圖3.7，整體上看高單位罐批與低單位罐批在補糖策略上沒有明顯差異，從圖3.4可以明顯看出低單位批次在后期總糖明顯高于高單位批次，說明低單位批次如果按照高批次相同的補糖策略，由于代謝相對

25、慢，導(dǎo)致糖積累。這種積累可能出現(xiàn)抑制次級代謝產(chǎn)物的可能，所以在生產(chǎn)控制中要根據(jù)殘?zhí)?、粘度、pH等參數(shù)綜合制訂糖的補加策略，而不能一成不變。補油的控制圖3.8 高單位批次罐(深色)和低單位批次罐(淺色)的補油差異 Fig 3.8 The addition difference of oil of high titer batch(dark) and low titer batch(light)從圖3.8中可以看出，高單位批次與低單位批次在補油量的差異比較明顯：高單位罐批表現(xiàn)了低補油速率。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是由于在現(xiàn)有設(shè)備中，供氧能力有限，如果補油量大，則氧的供應(yīng)不足。所以對所分析的批報而言，

26、相對少的補油量對發(fā)酵過程更為有利。 討論1.雖然從圖3.43.9給出了各個參數(shù)的合理控制范圍，但是發(fā)酵過程是復(fù)雜的多尺度系統(tǒng)，保持其它參數(shù)不變，而調(diào)節(jié)個別參數(shù)是不現(xiàn)實的，而且即便能夠?qū)崿F(xiàn)，也很難得到理想的效果，只能將這些參數(shù)綜合在一起才是解決問題的根本。例如圖3.8中，如果只是減少補油，而沒有采取其它提高溶氧的措施，以后新罐批的統(tǒng)計結(jié)果未必還是這樣。2.在對某一個圖形進(jìn)行分析的時候，不能脫離參數(shù)相關(guān)的思想，只有這樣才能對圖形體現(xiàn)的意義進(jìn)行深入分析。在制定工藝策略時，要區(qū)分可控參數(shù)和不可控參數(shù)。優(yōu)化的對象是可控參數(shù)，如初始的pH，總糖，溫度，壓力等。3.當(dāng)發(fā)酵過程中兩個參數(shù)不能同時控制到給出的范圍時，要優(yōu)先將相關(guān)性強的參數(shù)控制到它的高單位通道內(nèi)，相關(guān)性強弱需要通過表3.1進(jìn)行判斷，值越大，則相關(guān)性越強。4.軟件