白花丹素的體外肝毒性研究

1、白花丹素的體外肝毒性研究【摘要】目的觀察白花丹素在體外對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的作用及其在體外對(duì)人胚肝細(xì)胞L-2的毒性作用。方法采用TT法檢測(cè)不同濃度白花丹素對(duì)腫瘤細(xì)胞和人胚肝細(xì)胞L-2的毒性,比擬其I50值；采用紫外分光光度法測(cè)定白花丹素作用后肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SD,DA,LDH值的變化。結(jié)果白花丹素在體外具有較強(qiáng)抗腫瘤作用，同時(shí)對(duì)人胚肝細(xì)胞L-2有一定的毒性作用。結(jié)論白花丹素是優(yōu)良的抗腫瘤藥物，對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯毒性作用，同時(shí)具有一定肝毒性，使用時(shí)應(yīng)注意監(jiān)測(cè)肝功能?！娟P(guān)鍵詞】白花丹素；人胚肝細(xì)胞L-2；肝毒性Abstrat:bjetiveTdetettheantitureffetfplubaginan

2、dthetxiityfplubaginnhuanliverellL-2invitr.ethdsTTassayasperfredttestthetxiityfplubaginnturellandhuanliverellL-2.ThententsfSD,DAandLDHinulturalsupernateereeasuredbyultraviletspetrphtetry.ResultsPlubaginhadstrngtxiitynturells.PlubagininhibitedtheprliferatinfhuanliverellL-2inadse-dependentanner.nlusinP

3、lubaginisanexellentantiturdrug.Plubaginhastheinhibitryeffetnprliferatinfliverells.Keyrds:Plubagin；HuanliverellL-2；Txiityfliverell白花丹來(lái)源于藍(lán)雪科藍(lán)雪屬，主要分布于西南省份，廣西民間用于散瘡、消腫、通經(jīng)活絡(luò)，并治蛇傷、風(fēng)濕乳腺炎以及慢性氣管炎等癥。韋金育等1采用體外抗腫瘤藥物挑選TT法對(duì)50種廣西常用中草藥、壯藥進(jìn)展抗腫瘤挑選，在稀釋110時(shí)白花丹對(duì)肝癌細(xì)胞呈現(xiàn)明顯抑瘤作用，稀釋1100時(shí)白花丹仍有明顯抑瘤作用，在29種有抑瘤作用的藥物中，白花丹是具有明顯抑瘤作用的

4、5種藥物之一，白花丹素(plubagin5-羥基-2-甲基-1，4-萘醌)是白花丹的主要物質(zhì)根底，近年的研究結(jié)果說(shuō)明白花丹素是白花丹中具有抗腫瘤作用的主要成分2,3。一般來(lái)說(shuō)，抗腫瘤作用強(qiáng)的藥物毒性也大，其對(duì)肝的毒性如何，未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，我們考察了白花丹素對(duì)人肝細(xì)胞L-2的毒性作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。1材料與儀器1.1藥物與試劑白花丹素標(biāo)準(zhǔn)品中國(guó)藥品生物制品檢定所；四噻唑藍(lán)TTSiga公司；二甲基亞砜DSSiga公司；RPI1640培養(yǎng)基美國(guó)GIBBRL公司；胎生牛血清杭州四季青生物材料研究所公司；胰蛋白酶美國(guó)Ares公司公司；谷氨酰胺美國(guó)Ares公司；PBS美國(guó)Ares公司；注射用青霉素

5、鈉華北制藥股份；注射用硫酸鏈霉素大連美羅大藥廠；HEPESSiga公司；LDH試劑盒南京建成生物工程研究所；DA試劑盒南京建成生物工程研究所；SD試劑盒南京建成生物工程研究所。1.2儀器二氧化碳培養(yǎng)箱美國(guó)FraSientifi公司；倒置顯微鏡日本lypus公司；酶標(biāo)儀芬蘭ther公司；超低溫冰箱日本三洋公司；96孔培養(yǎng)板美國(guó)BI-RAD公司；超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備廠；臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；電子天平上海天平儀器廠；電熱恒溫水浴鍋北京市醫(yī)療設(shè)備廠；722S紫外分光光度計(jì)上海精細(xì)科學(xué)儀器。1.3細(xì)胞株人胚肝細(xì)胞L-2細(xì)胞株南京凱基生物科技開(kāi)展;人胃癌細(xì)胞SG7901，人乳腺癌細(xì)胞F-7，人腎

6、癌細(xì)胞ketr-3，人肝癌細(xì)胞BEL7404南京凱基生物科技開(kāi)展。2方法2.1溶液的配置取RPI-1640培養(yǎng)干粉以1000l三蒸水充分溶解，參加NaH32.0g,HEPES4.766g，參加青霉素、鏈霉素使其終濃度為100Ul-1，在超凈工作臺(tái)中過(guò)濾除菌，分裝成90l/瓶，-20保存?zhèn)溆?，臨用前加10l熱滅活56，30in胎牛血清。2.2梯度白花丹素溶液的制備精細(xì)稱(chēng)定白花丹素標(biāo)準(zhǔn)品適量用DS溶解后，用無(wú)血清培養(yǎng)液依次稀釋?zhuān)渲贸?1.25，62.5，125，250，500gl-1濃度梯度的白花丹素系列濃度樣品，置于4冰箱中保存?zhèn)溆谩?.3細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞株和人胚肝細(xì)胞L-2用含10%滅活新生

7、牛血清的RPI1640培養(yǎng)基參加谷氨酰胺0.24g/L并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為7.27.4，置于37，5%2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液每天更換，人胚肝細(xì)胞L-2每2天換液1次。實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活細(xì)胞數(shù)大于95%。2.4TT法測(cè)定白花丹素的體外抗腫瘤作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞株用胰酶消化后，用RPI-1640培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液參加96孔培養(yǎng)板，每孔180l，在52,37培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h待細(xì)胞完全貼壁后，實(shí)驗(yàn)組參加白花丹素標(biāo)準(zhǔn)液10l每藥三孔，陰性對(duì)照孔參加含0.5DS的無(wú)血清培養(yǎng)基20l，空白對(duì)照孔參加等量的含藥無(wú)血清培養(yǎng)基而無(wú)細(xì)胞，各孔加培養(yǎng)基至200l，培養(yǎng)箱孵育24，

8、48h，參加5g/l的TT10l，繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，取出96孔板傾去上清液，參加DS每孔150l，在搖床上振動(dòng)搖勻，在酶標(biāo)儀570n和630n的波長(zhǎng)下測(cè)得各孔D值。按下式計(jì)算白花丹素對(duì)各腫瘤細(xì)胞的抑制率。抑制率(%)對(duì)照組D值-實(shí)驗(yàn)組D值對(duì)照組D值100實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均抑制率。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.5TT法測(cè)定白花丹素的肝毒性按“2.4項(xiàng)下方法在96孔培養(yǎng)板中參加人胚肝細(xì)胞L-2懸液。待細(xì)胞完全貼壁后，實(shí)驗(yàn)孔參加系列濃度白花丹素20l每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)陰性對(duì)照孔和空白對(duì)照孔。培養(yǎng)箱孵育24，48h，同法測(cè)定白花丹素對(duì)人胚肝細(xì)胞L-2的抑制率，計(jì)算平均抑制率及I50值。2.6

9、紫外分光光度法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的SD，DA，LDH值取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人正常胚肝細(xì)胞L-2用胰酶消化后，用RPI-1640培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液參加6孔培養(yǎng)板，每孔1.9l，在52,37培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h待細(xì)胞完全貼壁后，實(shí)驗(yàn)孔參加125gl-1白花丹素標(biāo)準(zhǔn)品0.1l，另設(shè)空白對(duì)照組。在藥物作用的12，24，48h后，取培養(yǎng)液的上清液按SD，DA，LDH試劑盒中所述方法進(jìn)展SD，DA，LDH的測(cè)定。2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)以s表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)展處理。采用Bliss法求算I50值。3結(jié)果3.1TT法測(cè)定結(jié)果白花丹素組與空白對(duì)照組比擬，在31.25500g/l濃度范圍內(nèi)，吸收度A

10、值隨藥物濃度的增加逐漸減小，說(shuō)明白花丹素對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，且具有劑量相關(guān)性。結(jié)果見(jiàn)表1。同時(shí)白花丹素具有一定的肝毒性。結(jié)果見(jiàn)表2。表1白花丹素對(duì)腫瘤細(xì)胞的I50值略表2不同時(shí)間白花丹素L-02細(xì)胞株的毒性測(cè)定結(jié)果略3.2SD，DA，LDH測(cè)定結(jié)果用紫外光光度法測(cè)定培養(yǎng)上清液中的SD、DA、LDH值。結(jié)果見(jiàn)表3。表3紫外分光光度法測(cè)定白花丹素對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用略4討論肝臟是外源性化學(xué)物質(zhì)代謝的重要器官，在藥物眾多靶器官中無(wú)疑是最重要的，因此研究外源性化學(xué)物質(zhì)對(duì)肝的影響是毒理學(xué)研究的重要組成局部4。研究藥物肝毒性的傳統(tǒng)方法多采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所需樣品和動(dòng)物量大，提娶別離并純化大量

11、中藥成分比擬困難，實(shí)驗(yàn)本錢(qián)高。近年來(lái)，多種體外細(xì)胞培養(yǎng)體系已成為研究的有力工具，用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)展體外毒性分析已開(kāi)展為早期毒性評(píng)價(jià)的重要替代方法，在中藥新藥開(kāi)發(fā)早期建立有效的體外評(píng)價(jià)體系更是高通量挑選的手段之一5。本實(shí)驗(yàn)中，我們選取了來(lái)源體的人胚肝細(xì)胞L-2為試驗(yàn)對(duì)象，考察白花丹素在體外對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用。細(xì)胞建株通過(guò)在體外假設(shè)干次的傳代培養(yǎng)后根本可以消除不同人群的個(gè)體差異，具有很強(qiáng)的代表性，能實(shí)在反映出白花丹素的體外肝毒性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明白花丹素對(duì)人肝細(xì)胞L-2有一定的毒性作用，且其抑制細(xì)胞生長(zhǎng)隨藥物濃度的增加而增高。試驗(yàn)中白花丹素對(duì)腫瘤細(xì)胞I50值平均為45.24gl-1，對(duì)人正常胚肝細(xì)胞L

12、-2I50值為108.713gl-1。白花丹素對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性選擇指數(shù)SI為2.403，這說(shuō)明白花丹素對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的選擇性毒性作用，對(duì)肝毒性較校作為一個(gè)抗腫瘤藥物，具有較大的抗腫瘤活性，較低的毒性才能在臨床上得到應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為該藥的研究提供參考。國(guó)外有報(bào)道6，白花丹素可通過(guò)抑制啟動(dòng)階段或啟動(dòng)后階段致癌劑誘導(dǎo)的細(xì)胞過(guò)度增殖而對(duì)大腸癌具有預(yù)防作用。Srinivas等7研究了白花丹素誘導(dǎo)子宮癌細(xì)胞E-180凋亡的作用及其可能機(jī)制，結(jié)果顯示白花丹素可明顯抑制E-180細(xì)胞增殖，其可能機(jī)制是通過(guò)刺激E-180。細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生、損傷線粒體，使其膜電位下降，引起E-180細(xì)胞凋亡，而且E-180

13、細(xì)胞凋亡率與白花丹素濃度呈正相關(guān)性。白花丹素抗腫瘤機(jī)制至今未有明確報(bào)道，可能與自由基有關(guān)，細(xì)胞受到氧化損傷時(shí)，自由基及其過(guò)氧化反響產(chǎn)物破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞構(gòu)造，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死，細(xì)胞內(nèi)去除自由基酶的活性下降，導(dǎo)致其去除自由基才能下降，使肝細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重，膜通透性增高，肝細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)LDH，DA外泄8。據(jù)此，我們采用人胚肝細(xì)胞L2，以抗腫瘤藥物白花丹素誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷為模型，通過(guò)測(cè)定白花丹素作用后的肝細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，證明其機(jī)制可能與拮抗自由基產(chǎn)生，加強(qiáng)其去除和保護(hù)抗氧化酶活性有關(guān)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1韋金育，李延，韋濤，等.50種廣西常用中草藥、壯藥抗腫瘤作用的挑選研究J.廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2022，6

14、(4):3.2王希斌，黃慧學(xué)，劉華鋼，等.白花丹素和白花丹素-銅配合物體外抗腫瘤活性研究J.廣西中醫(yī)藥，2022，314:50.3LinL,YangLL,huJ.yttxinaphthquinnesandplubagiaidglusidesfrPlubagzeylaniaJ.phytheistry,2022,62:619.4GuilluzA.LiverelldelsininvitrtxilgyJ.EnvirnentalHealthPerspetives，1998，106(2):511.5劉慶,王旗,楊秀偉,等.基于NDKII細(xì)胞的中藥成分體外腎毒性評(píng)價(jià)J.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2022，216：521.6賈旭東.細(xì)胞增殖和細(xì)胞調(diào)亡與癌的發(fā)生和預(yù)防J.國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，2001，282:65.7SrinivasP，GpinathG，BanerjiA.Pl