色譜柱常見問題

1、-. z.高效液相色譜常見問題與解答1 何謂反相柱、正相柱？答：“反相”和“正相”的概念是液相色譜法早期提出的概念，當(dāng)時(shí)鍵合相色譜柱尚未出現(xiàn)，固定相被涂覆在載體外表，極易流失，為此科學(xué)家對流動相使用給出了合理的建議：流動相極性與固定液極性應(yīng)具有較大差異，以減少固定液流失。固定相極性弱于流動相時(shí)的液相色譜法被稱為反相色譜法，固定相極性強(qiáng)于流動相時(shí)的液相色譜法被稱為正相色譜法。盡管目前鍵合相色譜柱已成為主流，但這一概念在色譜方法開發(fā)、預(yù)測出峰順序等方面具有重要意義。由上面的介紹可知具體的色譜方法、色譜柱屬于正相還是反相不僅取決于固定相極性，同時(shí)還取決于流動相極性。C18(硅膠鍵合十八烷基硅烷)、C

2、8(硅膠鍵合辛基硅烷)、PH(硅膠鍵合苯基硅烷)等色譜柱，由于固定相極性極低，比目前的任何流動相的極性都要低，因而是標(biāo)準(zhǔn)的反相柱；Silica(硅膠)、NH2(硅膠鍵合氨丙基硅烷)具有較高的極性，主要用于別離帶有極性基團(tuán)的化合物，所用流動相的極性通常低于這些固定相，因而是標(biāo)準(zhǔn)的正相柱。(硅膠鍵合腈丙基)的極性適中，當(dāng)流動相極性超過時(shí)，它屬于反相柱，反之則是正相柱。2 色譜柱規(guī)格對分析結(jié)果會產(chǎn)生何種影響？答：色譜柱內(nèi)徑?jīng)Q定載樣量，載樣量與內(nèi)徑的平方成正比；色譜柱長度與塔板數(shù)成正比，與柱壓成正比；粒徑影響渦流擴(kuò)散相，粒徑越小渦流擴(kuò)散相越小，柱效越高，粒徑與柱效近似成反比；粒徑越小，壓力也越大，壓力

3、與粒徑的平方成反比。填料孔徑對分析對象的分子量有限制，當(dāng)孔徑為分析物尺寸的5倍以上時(shí)，分析物才能順利通過孔隙，孔徑處于60120 的色譜柱適用于相對分子量小于10000的分析物，孔徑為300 的色譜柱可以滿足分子量處于10000以上的大分子化合物分析。3 液相色譜分析中如何才能提高別離度？答：下式為別離度計(jì)算公式N：柱效(Efficiency)反映色譜柱性能，柱效越高，別離度越好。在其他條件恒定的情況下，塔板數(shù)增加一倍，別離度僅提高40%。操作中，可通過下面兩種方式增加塔板數(shù)進(jìn)而提高別離度：其一，使用長柱或雙柱串聯(lián)，但也會使別離時(shí)間大大延長；其二，使用細(xì)粒徑填料的色譜柱，但這需要耐更高壓力的液

4、相色譜系統(tǒng)。相比之下后者更為可取。：選擇性(selectivity)是指色譜柱-流動相體系別離兩個(gè)化合物的能力。選擇性主要與固定相、流動相組成以及柱溫等因素有關(guān)，與保存值也密切相關(guān)，其中固定相和流動相組成影響較大。以最常見的反相模式為例，反相柱(包括C18、C8、PH等)是以分配作用對化合物進(jìn)展保存的，不同化合物的別離是基于它們在鍵合相與流動相中分配系數(shù)的差異，如果兩種化合物的水溶性、在烷烴-水體系的分配系數(shù)等方面存在明顯差異，則這些化合物通常是能夠利用反相柱到達(dá)別離；PH柱對具有苯環(huán)的化合物具有特殊保存。正相模式下，硅膠柱、胺基柱、氰基柱與帶有極性基團(tuán)的化合物之間存在極性相互作用，對化合物的

5、基團(tuán)具有選擇性，常常用于構(gòu)造類似物、異構(gòu)體化合物的別離。流動相方面，降低流動相的洗脫強(qiáng)度通常可以增大別離度；而有機(jī)溶劑類型也會影響別離，比方反相條件下，乙腈和甲醇的選擇性就存在很大差異，這種差異需要在實(shí)踐中摸索，但無論如何，多種溶劑類型帶給我們更多的實(shí)現(xiàn)別離的可能。k：隨著容量因子k的增大，別離度也隨之增加，這種影響在k值較低時(shí)非常明顯，當(dāng)k值大于10時(shí)，k值增加對別離度的影響就不再顯著，這就告誡無原則地提高k值以增大別離度是沒有意義的。增加鍵合相密度能夠提高k值；另外改變鍵合基團(tuán)類型也能改變k值，比方在反相色譜中，隨著鍵合相碳鏈長度的增加，k值逐漸增大。4 色譜峰的峰形是怎樣衡量的？有何規(guī)定

6、？理論上講，色譜峰應(yīng)符合高斯曲線分布，然而實(shí)際上任何色譜峰都對高斯曲線分布存在一定的偏離，亦即不對稱。峰拖尾可以用不對稱因子(As)或USP拖尾因子(Tf)來衡量，顯然不對稱因子的說法更準(zhǔn)確，因?yàn)樯V峰存在前延、完美對稱、拖尾三種形態(tài)。一般來說，制藥行業(yè)以USP拖尾因子作為評測標(biāo)準(zhǔn)，而其他行業(yè)則多采用As來測定峰形。對于藥物分析，通常有明確的規(guī)定，Tf應(yīng)處于*一*圍之間，比方我國藥典規(guī)定*些藥物的拖尾因子應(yīng)處于0.951.05之間。其他行業(yè)尚無較為明確的規(guī)定。5 什么是梯度洗脫？什么情況下使用梯度洗脫？答：為了改善分析結(jié)果，*些操作需要連續(xù)改變流動相中各溶劑組分的比例以連續(xù)改變流動相的極性，使

7、每個(gè)分析組分都有適宜的容量因子k，并使樣品種的所有組分可在最短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)最正確別離，這種洗脫方式稱為梯度洗脫。梯度洗脫可在以下情形中發(fā)揮重要作用：A 在等度下具有較寬k值的多種樣品分析。B 大分子樣品分析。C 樣品含有強(qiáng)保存的干擾物，在目標(biāo)化合物出峰后設(shè)置梯度洗脫，將干擾物洗脫出來，以免其影響下一次數(shù)據(jù)采集。D 分析方法建立時(shí)，不知道其洗脫情況，使用梯度洗脫，找出其較優(yōu)的洗脫條件。6 何謂封端？封端的意義是什么？硅膠外表的硅羥基(Si-OH)密度為8 mol/m2，由于空間位阻的存在，硅烷化鍵合反響最多只能覆蓋50%的硅羥基，超過一半的硅羥基是活性硅羥基。這些硅羥基與化合物的極性基團(tuán)存在極性相

8、互作用和離子交換作用，為化合物的保存增加了不被期望的作用力，往往會影響峰形。用短鏈氯硅烷如三甲基氯硅烷鍵合活性的硅羥基，可以減小甚至消除這種影響，這種操作被稱為封端(Endcap)。封端處理的意義：抑制了特異性吸附，提高了色譜峰的對稱性，并改善了別離效果；在一定程度上掩蔽了硅膠外表，使其對堿性環(huán)境的耐受性增強(qiáng)；通過空間位阻掩蓋了鍵合反響形成的Si-O-Si鍵，使其對酸性環(huán)境的耐受性增強(qiáng)；可能會影響對極性樣品的選擇性。7 柱床塌陷和鍵合相塌陷柱床塌陷是指色譜柱使用一段時(shí)間后色譜柱入口處的柱床產(chǎn)生可見的空隙。該空隙的存在增大了死體積，會導(dǎo)致色譜柱柱效下降。造成柱床塌陷的原因如下：其一，色譜柱填裝時(shí)

9、的壓力過低，填裝不嚴(yán)密，在高壓下使用一段時(shí)間，開場出現(xiàn)空隙；其二，操作壓力超出色譜柱填料的耐壓值，導(dǎo)致填料顆粒破碎產(chǎn)生空隙；其三，流動相溶解填料導(dǎo)致空隙出現(xiàn)。鍵合相塌陷是指由于流動相極性與鍵合相極性相差太大，鍵合相無法在流動相中充分伸展而倒伏、纏結(jié)在一起，比方普通C18在純水相條件下。相塌陷會導(dǎo)致色譜柱對化合物的保存缺乏。8 系統(tǒng)壓力升高的原因及排除使用者通過觀察儀器的系統(tǒng)監(jiān)測掌握系統(tǒng)的壓力，如果發(fā)現(xiàn)壓力偏高，不要立即認(rèn)為“柱壓高了”，因?yàn)橄到y(tǒng)壓力通常由柱前壓力、色譜柱壓力和流通池壓力加合而成。此時(shí)正確的做法是：在操作條件下，測定系統(tǒng)壓力，得到p總；卸下色譜柱，在一樣條件下，測定柱前壓力，得到

10、p前；用兩通將泵流出管路與流通池連接，在操作條件下，測定壓力，得到p(前+后)。通過計(jì)算找出壓力高是來自柱前、色譜柱還是柱后。以上情形假設(shè)沒有安裝保護(hù)柱，如果安裝了保護(hù)柱，壓力升高時(shí)應(yīng)先測試保護(hù)柱的壓力，以便確認(rèn)問題是否來自保護(hù)柱。9 系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定通常情況下，泵壓的變動值超過了0.5 Mpa，系統(tǒng)壓力就屬于不穩(wěn)定的*疇。導(dǎo)致系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定的最直接原因?yàn)榱鲃酉嗔髁亢徒M成輸出的不穩(wěn)定，而導(dǎo)致流動相輸出不穩(wěn)定的原因通常包括溶劑互容性較差、系統(tǒng)漏液、系統(tǒng)存在氣泡以及輸液系統(tǒng)部件工作失效等等。下面將介紹排除“系統(tǒng)壓力不穩(wěn)”的方法。流動相輸出不穩(wěn)定還會導(dǎo)致基線不穩(wěn)定以及保存時(shí)間變化等現(xiàn)象，所以基線不穩(wěn)定

11、或保存時(shí)間不重現(xiàn)時(shí)，先看一下柱壓是否穩(wěn)定，如果不穩(wěn)定，三個(gè)問題可以合并處理。10 基線不穩(wěn)定基線不穩(wěn)定是指色譜曲線在較長時(shí)間*圍內(nèi)對響應(yīng)值的0刻度較大的偏離，通常包括基線漂移(單方向)、基線起伏(規(guī)律的上下起伏)、區(qū)域?qū)挾葮O大的色譜峰三種情況問題現(xiàn)象A 基線漂移B 基線波動C 寬大色譜峰如果基線不穩(wěn)定同時(shí)伴隨壓力波動，請按照“壓力不穩(wěn)定”進(jìn)展排查。如果壓力穩(wěn)定，請按下表中的方法進(jìn)展排查。11 噪聲升高噪聲baseline noise：由檢測器輸出與被測樣品組分無關(guān)的無規(guī)則波動信號，在特定靈敏度下用響應(yīng)單位表示。可分為高頻噪聲和短周期噪聲兩種。對于光譜型檢測器，噪聲的正常響應(yīng)值處于0.00000

12、5 V 0.00002 V之間(參考Shimadzu 的HPLC儀器)，高于此值，即可認(rèn)為噪聲偏高。噪聲升高時(shí)，先按以下步驟排查流動相問題噪聲升高時(shí)，假設(shè)流動相沒有問題，應(yīng)排查儀器的問題12 柱性能下降柱性能下降的一個(gè)重要現(xiàn)象就是在保存時(shí)間根本不發(fā)生變化的情況下，色譜峰的區(qū)域?qū)挾让黠@增大(如以下圖)。當(dāng)遇到柱效下降，請按下表進(jìn)展排查和解決13 保存時(shí)間重現(xiàn)性差當(dāng)保存時(shí)間的偏差超過2%，可以認(rèn)為保存時(shí)間的重現(xiàn)性差。對于*一個(gè)特定的分析，保存時(shí)間主要受流動相組成、流速、溫度以及固定相影響，當(dāng)保存時(shí)間發(fā)生明顯變化時(shí)，應(yīng)從這幾方面入手。A 由流動相造成的保存時(shí)間不穩(wěn)定B 由固定相造成的保存時(shí)間不穩(wěn)定1

13、4 峰形不理想理想的色譜峰遵循正態(tài)分布，應(yīng)該符合高斯曲線，是完美而對稱的峰形(如圖A)；然而由于化合物性質(zhì)的特殊性、色譜柱故障、操作條件等問題存在，峰形可能會不對稱，前延(B)或拖尾(C)。問題現(xiàn)象A 正常峰形B 峰前延C 峰拖尾峰形前延(B)中藥成分分析工程中，提取溶劑通常為乙醇、甲醇、乙酸乙酯等洗脫強(qiáng)度較強(qiáng)的溶劑，此時(shí)易發(fā)生“樣品溶劑的洗脫強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過流動相”的情況，為防止前延峰出現(xiàn)，可以用通過“流動相稀釋提取液”或降低“進(jìn)樣體積”的方式。峰形拖尾(C)15 鬼峰鬼峰(Ghost peak)：是對未知來源的色譜峰的統(tǒng)稱。16 氣泡峰氣泡峰是指攜帶氣泡的流動相通過檢測器時(shí)得到的響應(yīng)值；這里的氣泡可能是流動相中釋放的空氣，也可能是有機(jī)相遇水放熱而會釋放的有機(jī)溶劑分子；氣泡峰往往具有較高的響應(yīng)值，區(qū)域?qū)挾葍H為數(shù)秒，出峰時(shí)間和相應(yīng)值比擬有規(guī)律(如以下圖)。通常只有光譜型檢測器才會出氣泡峰。解決方法：脫氣使用多元梯度時(shí)，對每一種組分進(jìn)展脫氣，排除它們?nèi)?/p>