細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗步驟

1、細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗步驟細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗步驟簡單實(shí)驗步驟如下：漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度PBS 2小時.-20度甲醇固定20分鐘后，自然、干燥10分鐘PBS 洗凈：3min*34.1%Triton:25min-30min.配成 50ultriton+5mlpBSPBS 洗凈：2*5min羊血清封閉：37度，20分鐘一抗，4度過夜，一般要大于18小時或者3 7度 1 2小時8.4 度 PBS 洗凈，3min*5 次9.二抗 37度小于一小時10.37 度 PBS 洗凈，3*5min涼十封片（封閉液PH8. 5）活細(xì)胞免疫熒光技術(shù)一流式細(xì)胞儀標(biāo)本的制備（一）制備活性高的細(xì)胞懸液（培養(yǎng)細(xì)胞系、

2、外周血單個核細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞等均可用于本法）!用10%FCS RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為5X1061X107/ml!取40ul細(xì)胞懸液加入預(yù)先有特異性McAb（550U1） 的小玻璃管或塑料離心管，再加50ul 1：20（用DPBS 稀釋）滅活正常兔血清|4C 30min用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右1000rpmX5min!棄上清，加入50U1工作濃度的羊抗鼠（或兔抗鼠）熒光標(biāo)記物，充分振搖!4C 30min用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右1000rpmX5min!加適量固定液（如為FCM制備標(biāo)本，一般加入1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，視細(xì)胞濃度加入100

3、500 U1固定液）!FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察（標(biāo)本在試管中可保存57天）（二）試劑和器材各種特異性單克隆抗體。熒光標(biāo)記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清。10% FCS RPMI1640, DPBS、洗滌液、固定液（見附錄）。玻璃管、塑料管、離心機(jī)、熒光顯微鏡等。（三）注意事項整個操作在4C下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN 3,上述實(shí)驗條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假 陰性。加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防 止非特異性染色。細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異

4、性熒光染色。附：DPBS （X10,貯存液）NaCl 80gKCl 2g蒸餾水加至1000mlNa2HPO4 11.5g臨用時用蒸餾水1 ：10稀釋KH2PO4 2g洗滌液DPBS900mlFCS 50ml （終濃度 5%）4%NaN3 50ml （終濃度 0.2%）固定液DPBS1000ml葡萄糖20g （終濃度2%）甲醛10mlNaN3 0.2g （終濃度 0.02%）玻璃管、塑料管、離心機(jī)、熒光顯微鏡等。（三）注意事項整個操作在4C下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN 3,上述實(shí)驗條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗

5、相結(jié)合，出現(xiàn)假 陰性。加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防 止非特異性染色。細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。附：DPBS （X10,貯存液）NaCl 80gKCl 2g蒸餾水加至1000mlNa 2 HPO 4 11.5g臨用時用蒸餾水1 ：10稀釋KH2PO4 2g洗滌液DPBS900mlFCS 50ml （終濃度 5%）4%NaN3 50ml （終濃度 0.2%）固定液DPBS1000ml葡萄糖20g （終濃度2%）甲醛10mlNaN3 0.2g （終濃度 0.02%）嚴(yán)重同意樓上的講解。我是做流式細(xì)胞分析的間接熒光，圖簡單加一抗后只洗滌 一次，二抗后沒

6、有洗滌，就直接加另外一個抗體，結(jié)果做了好多次就是呈陰性反 應(yīng)！排除了好久才多洗滌了兩次，結(jié)果很是令人滿意。我想請問樓上：NaN3哪里有賣？謝謝！我找過，發(fā)現(xiàn)它是一種化學(xué)工業(yè)產(chǎn)品， 成桶成桶的賣，而且有劇毒啊！是不是不是同一種東東？我做的是zo-1的免疫熒光，步驟如下：1、細(xì)胞在蓋片上生長融合到95%-100%時，從孵箱中取出。2、用預(yù)溫的1XPBS洗3次，每次10分鐘3、4%的甲醛室溫固定20-30分鐘4、1XPBS洗3次，每次10分鐘5、0.2%Triton X-100 透化 2-5 分鐘6、1XPBS洗3次，每次10分鐘7、5%BSA室溫封閉30分鐘8、加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里

7、，4度過夜9、1XPBS洗3次，每次10分鐘10、加二抗（用1%BSA稀釋）30分鐘，閉光11、1XPBS洗3次，每次10分鐘12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA 均用 1 XPBS 稀釋從大鼠分離的T細(xì)胞能否直接做細(xì)胞免疫熒光我做的大部分細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的細(xì)胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。注意：有的時候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時候要小心，注意反正 面，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取，另外洗的時候MBS不要太沖，不 要細(xì)胞沖下來。洗的時候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10 分鐘。4%冷

8、的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。0.2%Triton X-100 通透 10 分鐘，PBS 洗三遍。與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時，感覺前者效果好，PBS洗三遍。二抗室溫2小時（避光），或者37度1半小時，PBS洗三遍。最好用DAPI染核，然后直接照熒光片。蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因為甘油不象樹脂那樣會 十，所以不用指甲油封的話會弄的一塌糊涂。建議：1.還是染完之后沒有封片前直接照一些，因為有的時候可能封片會出現(xiàn)問 題，再想照反而沒有了，另外不要拖太長時間，熒光會崔滅的。2.熒光的片子一 定要避光保存，保存的好

9、的話，過一段時間仍然能照出很好的片子。3.二抗用之 前一定離心，不然有的時候有那種沉淀，在片子上就是一個很大的非特異性熒光 光點(diǎn)，非常難看。我要做的是occludin，可是效果不是很好，可以用甲醇固定嗎，和甲醛比那個 合適各位同仁:我現(xiàn)在急于做人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的免疫熒光實(shí)驗，目的是測凋亡時，基因bax、 bcl-2的蛋白表達(dá)變化。不知道怎么選一抗和二抗試劑盒。請高手指教。萬分感謝!能發(fā)一個郵件更好，再一次感謝！我的 E-mail： .cn抗淬滅劑可拿來直接封片,20微升即可.之后片子可保留更長時間bu不是原創(chuàng)我是做懸浮細(xì)胞THP-1的，是人單核細(xì)胞系，主要問題是懸浮細(xì)胞在洗滌以及孵 育次

10、數(shù)多了會越洗越少，請問各位怎么洗法細(xì)胞不會變少。（離心轉(zhuǎn)速比較重要， 還有有人說離心后上清不用移液器吸，直接倒比較好，我也試過，可還是越來越 少）頂一下我也遇到了同樣的問題，不知那位高人能夠指點(diǎn)迷津？另懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞是不是 也需要先固定在做后面的處理？我聽說懸浮細(xì)胞是最后一步才固定，我的實(shí)驗步驟中太多道聽途說啊，沒辦法， 找不到完全相同的文獻(xiàn)，很多protocol都是針對貼壁細(xì)胞。不是懸浮細(xì)胞，是檢測的蛋白在細(xì)胞膜上的是最后一步固定MTT 分析法以活細(xì)胞代謝物還原劑 3-（4，5）-dimethylthiahiaz（-z-y1）-3 5-di- phenytetrazoliumromide M

11、TT唾唑藍(lán)為基礎(chǔ)。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的 染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開裂，生成藍(lán)色的formazan結(jié)晶，formazan結(jié)晶的生成量僅與活細(xì)胞數(shù)目 成正比死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。還原生成的formazan結(jié)晶可在含 50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉（pH 4.7）的 MTT溶解液中溶解，利用 酶標(biāo)儀測定490 nm處的光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。也可以用DMSO 來溶解。MTT粉末和溶液保存時都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。實(shí)驗的時候我一般關(guān)閉超 凈臺上的日光

12、燈來避光，覺得這樣比較好。一、步驟1、接種細(xì)胞用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔1000-10000個細(xì)胞接種到96 孔板，每孔體積200ul。2、培養(yǎng)細(xì)胞同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天可根據(jù)試驗?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時間)。3、呈色培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配)20ul繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)， 小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO ，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。4、比色選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐 標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。二、注

13、意事項1、選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。2、避免血清干擾：一般選小于10%的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗。在呈色后盡量吸盡 孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。3、設(shè)空白對照：與試驗平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致， 最后比色以空白調(diào)零。MTT實(shí)驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關(guān)系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50%的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度， 然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，然后得到50%抑制 率時候的藥品濃度，就是IC50。要點(diǎn)：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點(diǎn)線圖即可！三、舉例各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、

14、0.00001、0.000001，稀釋倍數(shù)為 10，最大濃度 為0.1，抑制率為0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入計算公式:Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025有一個公式可供參考；lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm : 1g最大劑量I尾最大劑量才目臨劑量)P :陽性反應(yīng)率之和Pm :最大陽性反應(yīng)率Pn :最小陽性反應(yīng)率抑制率

15、=1-加藥組OD值/對照組OD值公式中的最大最小陽性反應(yīng)率就是最大最小抑制率例：用96孔板培養(yǎng)SMMC-7721肝癌做MTT測細(xì)胞活力，應(yīng)該加多少1640培養(yǎng)基，多少 MTT 和DMSO 合適?根據(jù)書上說的加200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO 加DMSO 之前 要盡量去掉培養(yǎng)液，便于DMSO 溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測定一般每孔4000個細(xì)胞為宜，既細(xì)胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時后洗 掉上清液，注意不要將甲瓚洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然 后測吸光值。一般要低于IC50，避免非調(diào)亡性殺傷的細(xì)胞太多，造成流式細(xì)胞儀檢

16、測碎片太多。我 一般用1/2-1/的勺IC50，作用時間為36h。一般腫瘤細(xì)胞系空白處理的調(diào)亡率應(yīng)低于1%，用 藥后一般為5-10%(Annexin V)，細(xì)胞周期的亞G0峰比較明顯。一、開機(jī)程序1、檢查穩(wěn)壓器電源，打開電源，穩(wěn)定5分鐘。2、打開儲液箱，倒掉廢液，并在廢液桶中加入400ml漂白水原液。打開壓力閥，取 出鞘液桶，將鞘液桶加至4/5滿(一般可用三蒸水，做分選必須用PBS或FACSFlow)，合上 壓力閥。確實(shí)蓋緊桶蓋，檢查所有管路是否妥善安置。3、將FACSCalibur開關(guān)打開，此時儀器功能控制鈕的顯示應(yīng)是STANDBY ，預(yù)熱5-10 分鐘。排出過濾器內(nèi)的氣泡。4、如果需要打印

17、，打開打印機(jī)電源。5、打開電腦，等待屏幕顯示出標(biāo)準(zhǔn)的蘋果標(biāo)志。6、執(zhí)行儀器PRIME功能一次，以排除Flow Cell中的氣泡。7、分析樣品時，先用FACAFlow 或PBS進(jìn)行HIGH RUN 約2分鐘。8、做過分選后，每次開機(jī)后需沖洗管道：向分選裝置上裝上兩個50ml離心管，不接通 濃縮系統(tǒng)，摁下右下角白色按鈕開始沖洗。待自動停止后接通濃縮裝置，同上法沖洗一次。二、預(yù)設(shè)獲取模式文件(Acquisition Template Files)1、從蘋果標(biāo)志中選擇CELLQuest見一個新視窗，可利用此視窗編輯一個獲取模式文 件。2、選取屏幕左列繪圖工具中的Dot plot繪出一個或多個Dot P

18、lots點(diǎn)圖)。從Dot Plot 對話框中選取Acquisition為圖形資料來源，并確定適當(dāng)?shù)膞軸和y軸參數(shù)。3、選取屏幕左列繪圖工具中的Histogram，同上法可繪出Histogram（直方圖）。4、將此視窗命名后儲存于 FACStation G3BD Applications CELLQuest Folder EXP文 件夾中，下次進(jìn)行相同實(shí)驗時可直接調(diào)用。5、 本計算機(jī)中已設(shè)定兩個模式文件：ACQ 和EXP，儲存于FACStation G3BD Applications CELLQuest EXP文件夾中，ACQ用于細(xì)胞DNA檢測，EXP用于細(xì)胞表面標(biāo) 志分析。三、用CELLQue

19、st進(jìn)行儀器的設(shè)定和調(diào)整1、從蘋果畫面中選取CELLQuest，進(jìn)入CELLQuest后在File指令欄中打開合適的獲 取模式文件。2、從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Connect to Cytometer快捷鍵：+B）進(jìn)行電腦 和儀器的連機(jī)。將出現(xiàn)的Acquisiton Control話框移至合適位置。3、從 Cytometer 指令欄中，開啟 Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status 等四個對話框，并將它們移至屏幕右方，以便獲取數(shù)據(jù)時隨時調(diào)整獲取條件。也可以用+1， 2，3，4獲得此四個對話框。4、在Detectors/Amps對話框

20、中，先為每個參數(shù)選擇適當(dāng)?shù)谋对瞿Ｊ剑╝mplifier mode） 線性模式Lin或?qū)?shù)模式Log。一般進(jìn)行細(xì)胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴細(xì)胞亞群時， FSC和SSC多以線性模式Lin測量，且DDM Param 選擇FL2，而FL1， FL2與FL3則以 對數(shù)模式Log測量分析細(xì)胞DNA含量時，F(xiàn)SC，SSC，F(xiàn)L1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3皆以Lin進(jìn)行測 量，且DDM Param 選擇FL2;分析血小板表型時，F(xiàn)SC，SSC，F(xiàn)L1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3等均以Log 進(jìn)行測量。5、放上待檢測的樣品，將流式細(xì)胞儀設(shè)定于RUN，流速可在HIGH或LOW上。6、在Acquisiton Control話框中，

21、選取Acquire，開始獲取細(xì)胞。在以下的儀器調(diào)整 過程中隨時選取Pause，Restart以觀察調(diào)整效果。未完全調(diào)整好之前不要去掉SETUP前 的“ ”。7、 在Detectors/Amps對話框中，調(diào)整FSC和SSC探測器中的信號倍增度：PMT voltages粗調(diào)）與Amp Gains（細(xì)調(diào)），使樣品信號出現(xiàn)在FSC-SSC 點(diǎn)圖內(nèi)，且三群細(xì)胞合 理分布。8、在Threshold對話框中選擇適當(dāng)?shù)膮?shù)設(shè)定Threshold，并調(diào)整Threshold的高低， 以減少噪音信號（細(xì)胞碎片）。一般做細(xì)胞表型時用FSC-H而做DNA時用FL2-H。Threshold 并不影響檢測器對信號的獲取，但

22、可改善畫面質(zhì)量。9、從屏幕左列繪圖工具中選取Region（區(qū)域），并在靶細(xì)胞周圍設(shè)定區(qū)域線，即通常所 說的門。圈定合適的細(xì)胞群可使儀器調(diào)整更為容易。10、在Detectors/Amps對話框中，調(diào)整熒光檢測器（FL1， FL2，F(xiàn)L3，F(xiàn)L4等）的倍 增程度。根據(jù)所用的熒光陰性對照樣品調(diào)整細(xì)胞群，使之分布在正確的區(qū)域內(nèi)。11、在Compensation對話框中，根據(jù)所用的調(diào)補(bǔ)償用標(biāo)準(zhǔn)熒光樣品調(diào)整雙色或多色） 熒光染色所需的熒光補(bǔ)償。比如應(yīng)該為FL1+ FL2-的細(xì)胞群卻分布在FL1+ FL2+區(qū)域內(nèi)，則需調(diào)大FL2-?%FL1中的?”，并從FL1-FL2點(diǎn)圖中觀察新的調(diào)整是否恰當(dāng)12、在 St

23、atus對話框中可見：Laser Power:正常值一Run/Ready 為 14.7mW，Standby 為 5mW;Laser current:正常值為 6Amps 左右。13、調(diào)整好的儀器設(shè)定可在Instrument Settings對話框中儲存，下次進(jìn)行相同實(shí)驗時 可調(diào)出使用，屆時只需微調(diào)即可。四、通過預(yù)設(shè)的獲取模式文件進(jìn)行樣品分析1、 從蘋果標(biāo)志中選擇CELLQUEST，新視窗出現(xiàn)后從File指令欄中選擇Open，打開 預(yù)設(shè)的獲取模式文件。2、從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Connect to Cytometer進(jìn)行電腦和儀器的連機(jī)。 將出現(xiàn)的Acquisiton Contrc對話框移至合適位置。3、從Cytometer指令欄中選取Instrument Settings在其對話框中選擇Open以調(diào)出 以前存儲的相同實(shí)驗的儀器設(shè)定，按Set確定。4、在Acquire指令欄中，選擇Acquisition&Storage決定儲存的細(xì)胞數(shù)，參數(shù)，信號道 數(shù)。其中Resolution在做細(xì)胞表面標(biāo)志時選擇256,做DNA時選擇1024 oParameter Saved . 則根據(jù)不同的檢