臨床真菌學(xué)檢驗(yàn)基本的技術(shù)

1、關(guān)于臨床真菌學(xué)檢驗(yàn)基本技術(shù)第1頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四臨床真菌基礎(chǔ)總論一、真菌的基本介紹二、真菌分類及存在形式三、真菌的一般檢查 一般鏡檢 常規(guī)染色 培養(yǎng)及鑒定方式四、真菌的致病性五、真菌的防治原則第2頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四真菌(fungus)屬真核細(xì)胞型微生物，有真正的核，單細(xì)胞或多細(xì)胞異養(yǎng)微生物，不含葉綠素，大都能形成硬的多糖細(xì)胞壁，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較細(xì)菌簡(jiǎn)單，細(xì)胞壁含幾丁質(zhì)和纖維素 。估計(jì)有100-150萬(wàn)種，分布廣泛，從30000米高空地表海洋都有真菌的生長(zhǎng)。大多數(shù)真菌對(duì)人類是有益的，只有少數(shù)對(duì)人類有害。一、真菌的基本介紹

2、第3頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四二、真菌分類及存在形式A、真菌分類從米奇里（P.A.Micheli，1729）開始，至今已有近280年的歷史，這期間經(jīng)過(guò)世界上無(wú)數(shù)真菌科學(xué)工作者的努力，使真菌分類的工作有了極大地發(fā)展。B、但是由于真菌分類存在著無(wú)數(shù)困難，現(xiàn)有的真菌分類系統(tǒng)還有待進(jìn)一步發(fā)展與完善（尚未有一個(gè)大家供認(rèn)的系統(tǒng)）。 （1）、真菌的分類第4頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四1、Ainsworth（1973）分類系統(tǒng) 特點(diǎn)：成立菌物界，分2門，真菌門下分成5個(gè)亞門；取消藻狀菌綱，依據(jù)鞭毛的有無(wú)劃分成鞭毛菌亞門、接合菌亞門。2、Alexop

3、oulos & Mims （1979） 分類系統(tǒng)特點(diǎn)：成立菌物界，菌物界Myceteae、Fungi分3個(gè)門；真菌類依鞭毛的有無(wú)分2門。3、菌物分別歸屬藻界、真菌界、和原生生物界的分類系統(tǒng)特點(diǎn)：將藻界、真菌界、和原生生物界分開成三個(gè)獨(dú)立的界屬二、真菌分類及存在形式第5頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四與醫(yī)學(xué)有關(guān)的真菌有四個(gè)亞門接合亞門：毛霉、根霉等子囊霉亞門：酵母菌屬、小孢子霉屬等擔(dān)子霉亞門：新生隱球菌、靈芝、食用菌等半知霉亞門：假絲酵母菌屬、球孢子菌屬等最新的真菌分類接合菌門子囊菌門擔(dān)子菌門壺菌門第6頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四根據(jù)菌落形

4、態(tài)分類：酵母菌酵母樣菌霉菌雙相真菌第7頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四二、真菌分類及存在形式（2）、真菌的存在形式菌絲和孢子A、真菌的菌絲先端為生長(zhǎng)點(diǎn)，通過(guò)頂端延長(zhǎng)而生長(zhǎng)。菌絲生長(zhǎng)生出分枝，使其與營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)接觸面積增大，提高吸收力。菌絲內(nèi)原生質(zhì)從衰老部分流向幼嫩部分，使菌絲不斷伸長(zhǎng)，這就是生長(zhǎng)。B、在一定條件下由生長(zhǎng)轉(zhuǎn)入發(fā)育階段即產(chǎn)生繁殖體，生長(zhǎng)與發(fā)育受環(huán)境控制，多數(shù)真菌在貧養(yǎng)和低溫條件下轉(zhuǎn)入有性階段，少數(shù)菌在高溫下轉(zhuǎn)入有性階段。還有些真菌在其不同的發(fā)育階段，必須在不同的寄主植物上渡過(guò)，即轉(zhuǎn)主寄主（現(xiàn)象）。C、只要是專門生殖的細(xì)胞，正常情況下不需要兩兩結(jié)合就可以單個(gè)細(xì)胞

5、發(fā)育成一個(gè)個(gè)體，這就是孢子。 第8頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四菌絲的形態(tài)： 螺旋狀、球拍狀、結(jié)節(jié)狀、鹿角狀、梳狀等，菌絲形態(tài)有助于鑒別真菌。孢子的形態(tài)：有性孢子：同一個(gè)菌體或不同菌體上兩個(gè)細(xì)胞融合成經(jīng)減數(shù)分裂形成。無(wú)性孢子：細(xì)胞分化或出芽形成。形態(tài)有分生孢子、葉狀孢子和孢子囊孢子。第9頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四菌絲和孢子第10頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四第11頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四三、真菌的一般檢查（1）、一般鏡檢A、氫氧化鉀法 將標(biāo)本置于在玻片上，加一滴10%KOH

6、浮載液，蓋上蓋玻片放置510分鐘后或直接在火焰上快速通過(guò)23次微加熱，輕壓蓋玻片驅(qū)逐氣泡并將標(biāo)本壓薄后置于顯微鏡下檢查。先在低倍鏡下觀察有無(wú)菌絲和孢子，然后用高倍鏡觀察孢子和菌絲的形態(tài)特征、大小和排列等。對(duì)于角質(zhì)標(biāo)本，必要時(shí)可在10%KOH溶液中，加入終濃度為40%二甲亞砜，促進(jìn)其溶解。此法適用于皮屑、甲屑、毛發(fā)、痂皮、痰、組織、耵聹、糞便等標(biāo)本的直接涂片檢查。第12頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四B、膠帶粘貼法三、真菌的一般檢查（1）、一般鏡檢 用透明膠帶直接貼于取材部位，數(shù)分鐘后揭下，充分展平后，直接置貼于加有一滴浮液的載玻片上此液可以是10%20%的KOH，也可

7、以采用乳酸酚棉藍(lán)染液（易于觀察）。該法常用于花斑癬患處的直接檢查。第13頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四三、真菌的一般檢查（2）、常規(guī)染色乳酸酚棉藍(lán)染色傳統(tǒng)染色法，酵母菌細(xì)胞、菌絲體和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等皆可被染成亮藍(lán)色；背景為暗淡的藍(lán)色。過(guò)碘酸-雪夫染色（P.A.S）在尋找真菌孢子、鑒別真菌、觀看真菌結(jié)構(gòu)、等方面有意義 其他染色法六胺銀法、愛先藍(lán)（alcian blue）法、革蘭氏染色法、以及特殊染色法第14頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四 于潔凈載玻片上，滴1-2滴乳酸酚棉藍(lán)染色液，用解剖針從霉菌菌落的邊緣外取少量帶有孢子的菌絲置于染色液中，再細(xì)心

8、地將菌絲挑散開，然后小心地蓋上蓋玻片(加熱或不加熱)，注意不要產(chǎn)生氣泡。置顯微鏡下先用低倍鏡觀察，必要時(shí)再換高倍鏡。乳酸酚棉藍(lán)染色第15頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四革蘭染色法在鑒別細(xì)菌、選擇抗菌藥物、研究細(xì)菌致病性等方面有意義 （真菌的簡(jiǎn)單染色也可以）所有的真菌、放線菌均為革蘭染色陽(yáng)性，呈紫黑色。適用于酵母菌、孢子絲菌、組織胞漿菌、諾卡菌及放線菌等培養(yǎng)物的形態(tài)檢查。石膏樣小孢子菌第16頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四第17頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四三、真菌的一般檢查（3）、培養(yǎng)及鑒定方式A、培養(yǎng)特性營(yíng)養(yǎng)-水

9、、鹽、氮源、碳水化合物環(huán)境-弱酸性（pH 46）溫度（2228），充分氧氣B、抵抗力對(duì)紫外線及一般消毒劑耐受性強(qiáng)對(duì)熱的抵抗力不強(qiáng)，60以上1小時(shí)即可殺死孢子及菌絲在1%3%石炭酸2.5%碘酊、0.1%升汞及10%甲醛中可被滅活用甲醛氣體熏蒸被真菌污染的衣物用具，可殺滅真菌菌絲及其孢子第18頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四三、真菌的一般檢查（3）、培養(yǎng)及鑒定方式D、培養(yǎng)基種類沙保氏培養(yǎng)基血平板柯馬佳等常規(guī)培養(yǎng)鑒別E、菌落形態(tài)第19頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四F、鑒定方式三、真菌的一般檢查（3）、培養(yǎng)及鑒定方式一、形態(tài)學(xué)鑒定1、致病真菌的鑒定

10、，需要光鏡，現(xiàn)在更加上熒光顯微鏡和細(xì)胞化學(xué)，還有各種染色法。2、需要培養(yǎng)來(lái)鑒定菌種，選擇合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定菌種，是常用的方法。3、現(xiàn) 代 形 態(tài)學(xué)技術(shù)，如自動(dòng)成像分析、電子顆粒體積、分?jǐn)?shù)幾何學(xué)分析形態(tài)學(xué)的特點(diǎn)。二、分子生物學(xué)鑒定1、表型 分 類 受限，生理生化技術(shù)在絲狀真菌鑒定方面，或是費(fèi)時(shí)費(fèi)事或是結(jié)果不準(zhǔn)。2、PCR技術(shù)，可以分析少量真菌細(xì)胞，甚至單個(gè)真菌抱子。3、選擇通用寡核昔酸對(duì)真菌種特異性引物，測(cè)定其核昔酸序列。三、其他鑒定1、次級(jí)代謝產(chǎn)物的測(cè)定：它是一個(gè)與分了有關(guān)的混合物，有特殊的和極罕見的化學(xué)結(jié)構(gòu)。常見的是固醇、菇、類堿、香豆素等，某些是真菌毒素。2、細(xì)胞壁組份的測(cè)定等第20頁(yè)，

11、共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15分，星期四A、真菌的侵犯部位不同，其致病性也不相同淺部真菌侵犯表皮角質(zhì)層、毛發(fā)和甲板深部真菌侵犯真皮及以下組織、粘膜和內(nèi)臟。B、真菌的致病性表現(xiàn)1. 淺部真菌感染（外源性真菌）:手足癬、體癬、股癬、甲癬2.條件致病性真菌感染（內(nèi)源性真菌/機(jī)會(huì)致病性真菌）如：白假絲酵母菌（白色念珠菌）引起的鵝口瘡3.深部真菌感染:新生（型）隱球菌：侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起慢性腦膜炎4.真菌毒素的致病作用:急性中毒：毒蕈中毒，慢性真菌中毒：黃曲霉素、青霉素（霉變食物）5. 真菌超敏反應(yīng)性疾病:敏感患者吸入真菌孢子，引起型超敏反應(yīng)醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理。如：尋痲疹、哮喘、變應(yīng)性鼻炎等。四、真菌的致病性第21頁(yè)，共24頁(yè)，2022年，5月20日，17點(diǎn)15