動物細胞工程制藥的研究進展

1、10/10動物細胞工程制藥的研究進展1161001413167 劉星星摘 要：動物細胞工程制藥是動物細胞技術(shù)在生物制藥工業(yè)方面的應用。本文介紹了動物細胞工程制藥所涉及的主要技術(shù)及其進展，包括動物細胞融合技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)和細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)等，在此基礎(chǔ)上探討了動物細胞工程制藥的發(fā)展趨勢。關(guān)鍵詞：動物細胞工程；生物制藥；細胞融合；轉(zhuǎn)基因動物；細胞培養(yǎng)目錄 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc354407941 一、引言 PAGEREF _Toc354407941 h 3 HYPERLINK l _Toc354407942 二、動物細胞工程簡介 PAGEREF _To

2、c354407942 h 3 HYPERLINK l _Toc354407943 （一）生產(chǎn)用動物細胞 PAGEREF _Toc354407943 h 3 HYPERLINK l _Toc354407944 1.原代細胞 PAGEREF _Toc354407944 h 3 HYPERLINK l _Toc354407945 2.傳代細胞系(continuous cell lines,CCL) PAGEREF _Toc354407945 h 4 HYPERLINK l _Toc354407946 3.工程細胞系 PAGEREF _Toc354407946 h 4 HYPERLINK l _Toc

3、354407947 4.轉(zhuǎn)化細胞系 PAGEREF _Toc354407947 h 4 HYPERLINK l _Toc354407948 （二） 動物細胞工程制藥技術(shù) PAGEREF _Toc354407948 h 5 HYPERLINK l _Toc354407949 1.細胞融合 PAGEREF _Toc354407949 h 5 HYPERLINK l _Toc354407950 2.轉(zhuǎn)基因動物 PAGEREF _Toc354407950 h 5 HYPERLINK l _Toc354407951 3.細胞核移植技術(shù) PAGEREF _Toc354407951 h 6 HYPERLIN

4、K l _Toc354407952 4.動物細胞大規(guī)模培養(yǎng) PAGEREF _Toc354407952 h 7 HYPERLINK l _Toc354407953 三、發(fā)展前景REF _Toc354407953 h 8 HYPERLINK l _Toc354407954 四、結(jié)論 PAGEREF _Toc354407954 h 8參考文獻9一、引言動物細胞工程制藥是動物細胞技術(shù)在生物制藥工業(yè)方面的應用。本文介紹了動物細胞工程制藥所涉及的主要技術(shù)及其進展，包括動物細胞融合技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)和細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)等，在此基礎(chǔ)上探討了動物細胞工程制藥的發(fā)展趨勢。二、動物細胞工程簡介所謂動物細胞工程，

5、是根據(jù)細胞生物學及工程學原理，定向改變動物細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)從而獲得新型生物或特種細胞產(chǎn)品的一門技術(shù)。這一技術(shù)在生物制藥的研究和應用中起關(guān)鍵作用，目前全世界生物技術(shù)藥物中使用動物細胞工程生產(chǎn)的已超過80% ，例如蛋白質(zhì)、單克隆抗體、疫苗等。當前動物細胞工程制藥所涉及的主要技術(shù)領(lǐng)域包括細胞融合技術(shù)、細胞核移植技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)和細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)等方面。本文就動物細胞工程制藥所采用的細胞種類及相關(guān)技術(shù)等進行綜述。 （一）生產(chǎn)用動物細胞 目前用于生物制藥最4類，即原代細胞、二倍體細胞系、融合的或重組的工程細胞系和轉(zhuǎn)化細胞系。 1.原代細胞原代細胞是直接取自動物組織器官,經(jīng)過粉碎消化而獲得的細胞懸液

6、。動物細胞生產(chǎn)生物藥品的早期，一般用原代培養(yǎng)的細胞來生產(chǎn)疫苗，如雞胚細胞、原代兔腎細胞、鼠腎細胞、淋巴細胞等，Ender 最先用原代培養(yǎng)的猴腎組織細胞來生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗。原代細胞增殖能力有限，需要大量動物才能增加產(chǎn)量，費錢費力，限制了它的應用。2. continuous cell lines,CCL)原代細胞經(jīng)過傳代篩選克隆，從多種細胞成分中挑選并純化出某種具有一定特征的細胞株稱為 CCL。許多 CCL 建立于 50年代，用它們來生產(chǎn)疫苗不僅可以降的量，并且因為所用的細胞性質(zhì)均一，通過體外大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的疫苗可以保證質(zhì)量，避免了動物個體差異產(chǎn)生的疫苗質(zhì)量不穩(wěn)定問題。但 C C L 在

7、生物學特性上與腫瘤細胞有許多相似之處, 有時是從腫瘤細胞衍生而來, 由于缺乏有效的科學手段來排除其潛在的致瘤性, 因而數(shù)十年間未允許 C C L 用于生產(chǎn)。7 0 年代以后，大量研究工作證實了二倍體細胞的I-38 是第一個生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的二倍體細胞系。二倍體細胞系一般從動物胚胎組織中獲取，有明顯的貼壁和接觸抑制特性，有正常細胞的核型，一般可傳代培養(yǎng) 5 0 代，且無致瘤性，現(xiàn)在C C L 已被廣泛用于人用治療性藥物的生產(chǎn)，但仍不是理想的生產(chǎn)細胞系。表 1 列出了一些常用的生產(chǎn)用動物細胞系。3.工程細胞系 工程細胞系是指采用基因工程技術(shù)或細胞融合技術(shù)對宿主細胞的遺傳物質(zhì)進行修飾改造或重組

8、，獲得具有穩(wěn)定遺傳的獨特性狀的細胞系。用于構(gòu)建工程細胞的動物細胞有 BHK-21、CHO-dhfr、Namalwa、Vero、SP2/0、Sf-9 等細胞系1-2。SP2/0 - A g 1 4 工程細胞系是通過融合的方法，從抗羊紅細胞活性的 B A L B / c 的小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞系 P 3 X 6 3 A g 8 融合雜交瘤SP2/NL-Ag 亞克隆中分離獲得，可用于生產(chǎn)單克隆抗體2。目前用重組 D N A 技術(shù)改造的 C H O 細胞生產(chǎn)干擾素、白介素、E P O 、單克隆抗體、診斷試劑以及其它各種蛋白質(zhì)類藥品已成為國際醫(yī)藥市場上的熱銷產(chǎn)品，但這些產(chǎn)品的生產(chǎn)規(guī)模普遍較小(大多為

9、550 升的小型培養(yǎng)罐)5。4.轉(zhuǎn)化細胞系 通過某個轉(zhuǎn)化過程形成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細胞特點，而獲得無限增殖能力。轉(zhuǎn)化細胞系具有長期培養(yǎng)，倍增時間短，對培養(yǎng)條件和生長因子等要求較低的特點，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。在生物制藥中，可通過改造宿主細胞特性，如延長細胞周期提高工程細胞原始表達水平等來提高藥物的產(chǎn)量。李紅艷等研究空間環(huán)境對 CHO(dhfr )細胞生長特性的影響，結(jié)果表明空間誘變致生長減慢的細胞株有利于提高目的蛋白的產(chǎn)量，為篩選優(yōu)化的生物工程制藥細胞提供可能3。目前 cHo(dhfr )作為重要的基因表達受體細胞，已成功應用于表達促紅細胞生成素(EPO) 、重組乙型肝炎

10、疫苗等生物制藥領(lǐng)域4-5。 （二） 動物細胞工程制藥技術(shù)1.細胞融合 細胞融合指在誘導劑或促融劑作用下，兩個或兩個以上的異源細胞或原生質(zhì)體相互接觸，進而發(fā)融合并形成雜種細胞的現(xiàn)象。細胞融合技術(shù)作為細胞工程的核心基礎(chǔ)技術(shù)之一，不僅在農(nóng)業(yè)、工業(yè)的應用領(lǐng)域不斷擴大，而且在醫(yī)藥領(lǐng)域也取得了開創(chuàng)性的研v勻克隆抗體、疫苗等生物制品的生產(chǎn)。在動物體細胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上 Kohler G和 Milstein C將能產(chǎn)生特異性抗體的原代 B 淋巴細胞與腫瘤細胞進行融合，創(chuàng)立了單克隆抗體制備的方法5。國內(nèi)外已培育出了許多具有很高實用價值的雜交瘤細胞株系，它們能分泌用于疾病診斷和治療的單克隆抗體，如甲肝病毒、抗人

11、I g M 、抗人肝癌和肺癌、抗M-CSFR（Macrophage Colony-Stimulat-ing Factor Receptor，巨噬細胞集落刺激因子受體）胞外區(qū)的單克隆抗體等7-9。目前單克隆抗體技術(shù)已趨成熟，許多產(chǎn)品已經(jīng)進入產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)階段。此外利用細胞融合技術(shù)可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，腫瘤細胞 / 樹突狀細胞融合疫苗是近年來國內(nèi)外惡性腫瘤免瘀熱點, 在各種動物模型及病人身上觀察到腫瘤的消退9-11。Avigan 等將乳腺癌或腎癌病人的自體癌細胞與樹突狀細胞在含有人粒 - 巨噬細胞集落刺激因子、白介素 - 4 的自體血清中培養(yǎng)，加入聚乙二醇使兩種細胞產(chǎn)生融合, 融合細胞疫苗能使腫瘤消

12、退10，顯示其在腫瘤治療方面具有良好的應用前景。2.轉(zhuǎn)基因動物 利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺反應器生產(chǎn)藥用或食品蛋白是生物制藥領(lǐng)域近年來研究的熱點之一。因為乳腺是一個外分泌器官，乳汁不進入體內(nèi)循環(huán)，不會影響到轉(zhuǎn)基因動物本身的生理反應，從轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中獲取的目的基因產(chǎn)物，不但產(chǎn)量高、易提純，而且表達的蛋白經(jīng)過了充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性，因此又被稱為動物乳腺生物反應器，所以用乳腺表達人類所需蛋白基因的羊、牛等產(chǎn)量高的動物就相當于一座藥物工廠。20 世紀 80 年代中期，英國科學家克拉克首先在鼠的乳腺組織高效表達了人抗胰蛋白酶因子基因，開創(chuàng)了研制動物乳房生物反應器的先河13-14。 據(jù)美國遺傳學

13、會預測，到2010年，所有基因工程藥物中利用動物乳房生物反應器生產(chǎn)的份額將高達95。國外現(xiàn)已有數(shù)十家以動物乳腺反應器為核心技術(shù)的公司，可生產(chǎn) 1 抗胰蛋白酶、人紅細胞生成素、乳鐵蛋白、人血清白蛋白、人血紅蛋白及人凝血因子、和抗凝血酶、血纖維蛋白原、t P A 等十余種稀有藥品，但只有為數(shù)極少的幾種藥用蛋白上市。2006 年 6 月，由美國 Genzyme 轉(zhuǎn)基因公司研制成功的世界上第一個利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應器生產(chǎn)的基因工程蛋白藥 物 棗 重 組 人 抗 凝 血 酶 （ 商 品 名 ：ATryn 牋）已經(jīng)獲準上市12。 我國自 1998 年在國家“863 ”計劃中將“轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應

14、器”作為重大研究項目以來，也取得了一些較好的成績。1996 年研制成功的能在乳腺中表達人凝血因子、EPO 的轉(zhuǎn)基因羊；1 998 年曾溢滔等獲得了能表達人血清白蛋白的轉(zhuǎn)基因奶牛; 2 0 0 0 年中國農(nóng)業(yè)大學與北京興綠原生物技術(shù)中心合作，成功獲得了我國首例轉(zhuǎn)有人 a l 一抗胰蛋白酶基因的轉(zhuǎn)基因羊1131；2005 年中國農(nóng)業(yè)大學和北京濟普霖生物技術(shù)有限公司聯(lián)合研制的人乳鐵蛋白和人乳清白蛋白轉(zhuǎn)基因奶牛均獲得高效表達，含量分別達到3.4 克 / 升和 1.5升，標志了我國首次獲得可商業(yè)化生產(chǎn)的動物乳腺生物反應器重組人類蛋白15-16。目前科學家們正在加緊開展重組蛋白純化、臨床前試驗和臨床試驗等

15、研究，力爭早日實現(xiàn)我國動物乳腺生物反應器制藥技術(shù)產(chǎn)業(yè)化。3.細胞核移植技術(shù) 細胞核移植技術(shù)，是指將一個動物細胞的細胞核移植至去核的卵母細胞中，產(chǎn)生與供細胞核動物的遺傳成份一樣的動物的技術(shù)。科學家們已經(jīng)先后在綿羊、小鼠、牛、豬、山羊等動物上獲得胚胎細胞核移植后代，目前，體細胞克隆也在牛、山羊、小鼠等物種上均獲得了成功。若將轉(zhuǎn)基因與細胞核移植技術(shù)獲得的克隆動物工廠相結(jié)合，在生物制藥方面具有巨大的潛在應用價值。1998 年，Rohl 等用非靜息期胎兒或纖維細胞成功克隆出 3只健康、同類的攜帶外源標記基因的轉(zhuǎn)基因克隆17。Schnieke 等18用此法成功克隆出 3 只攜&嘀子 X 基因轉(zhuǎn)染綿羊早期胎

16、兒成纖維細胞，以該細胞系為供體移植到去核卵母細胞中，經(jīng)過電和化學刺激后，將卵母細胞植入假孕母綿羊體內(nèi)發(fā)育，獲得這 3 只綿羊，這 3 只綿羊能高水平地表達人凝血因子 X （125 g/ml ）。Cibelli等19同樣也獲得3頭轉(zhuǎn)基因牛。這些研究展示了轉(zhuǎn)基因克隆動物技術(shù)的可能性，為細胞工程制藥帶來了光明前景。4.動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的大規(guī)模高效培養(yǎng)技術(shù)是生物制藥的關(guān)鍵技術(shù)，通過動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物產(chǎn)品已成為全球生物工業(yè)的主要支柱。目前動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)較多的生物制劑是蛋白和抗體，通常采用中國倉鼠的卵巢細胞，事先將能產(chǎn)生某種蛋白質(zhì)藥品的基因片段與倉鼠卵巢細胞的 D N A 融合再在培養(yǎng)液中大

17、量培養(yǎng)它們、最后得到所需藥品。與微生物發(fā)酵法比，雖然產(chǎn)量相對較低。但設(shè)備費用節(jié)省得多，如屬于小品種、小產(chǎn)品類生物工程產(chǎn)品，可采用此法。目前用于動物細胞體外培養(yǎng)的生物反應器有機械攪拌式、氣升式、中空纖維式、回轉(zhuǎn)生物反應器等。國外占主流優(yōu)勢的是攪拌式生物反應器懸浮培養(yǎng)，為提高細胞的產(chǎn)率，可采用流加或灌注培養(yǎng)及微載體培養(yǎng)等相關(guān)技術(shù)20-21。美國 Genentech 公司使用 CHO 細胞以 12,000L 攪拌式生物反應器培養(yǎng)槽生產(chǎn) t - P A 重組蛋白以及治療癌癥的生物藥物。美國 G i b c o 公司建立的流加懸浮培養(yǎng) rCHO 表達 r Gal 系統(tǒng)，采用化學修飾的無蛋白 C H O

18、細胞培養(yǎng)基并增加 T C A 循環(huán)，生物反應器中活細胞密度最高可達 107cell/ml。國內(nèi)第四軍醫(yī)大學采用5L CelliGen 反應器連續(xù)灌注培養(yǎng)雜交瘤細胞，培養(yǎng)第 9 天細胞密度達到8 106cells/ml 以上22。目前國內(nèi)未見有萬升級的生物反應器用于生產(chǎn)的報道，同時我國有關(guān)商品化大規(guī)模動物細胞反應器產(chǎn)品還處于空白，有待于進一步改進現(xiàn)有生物反應器設(shè)計或設(shè)計新型的生物反應器。三、發(fā)展前景根據(jù)我國動物細胞工程制藥的現(xiàn)狀，今后應該將重點放在以下方面：1.建立動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)平臺。該技術(shù)是轉(zhuǎn)基因工程藥物、單克隆抗體及疫苗等產(chǎn)品的關(guān)鍵技術(shù)，主要由以下幾個要素構(gòu)成： 2.高效的真核細胞

19、表達系統(tǒng)。中國倉鼠卵巢細胞( C H O ) 作為宿主細胞表達的外源蛋白最接近其天然構(gòu)象，是生物制藥最為理想的表達系統(tǒng)，但也存在一些問題，如表達量低、大規(guī)模培養(yǎng)困難、生產(chǎn)成本高昂。我們應從工程細胞本身著手，對細胞本身的生理特征進行改造，除了要求目的蛋白的表達量高外，必須適應無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，具有即抗細胞衰老凋亡能力； 3.性能優(yōu)越的、個性化的細胞培養(yǎng)基，包括低血清培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基； 4.先進的生物反應設(shè)備；5.減少污染風險、提高產(chǎn)品質(zhì)量和安全性；6.實行“動物藥廠”計劃，盡快實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應器的產(chǎn)業(yè)化；7.發(fā)展下游工程，主要是轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物及產(chǎn)品的分離純化，在提高產(chǎn)品的純度和產(chǎn)量

20、同時，降低成本。四、結(jié)論總之，我國動物細胞工程制藥目前仍處于起步階段，與歐美國家相比還有很大差距，雖然目前可生產(chǎn)多種有重要價值的蛋白質(zhì)生物制品，如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等，但大部分還處于實驗和臨床階段。隨著生命科學的發(fā)展和細胞工程技術(shù)研究的深入，將會有更多的細胞工程藥物出現(xiàn)，具有廣闊的應用前景。 參考文獻：1姜倩倩,劉京貞,蘇瑞強.單克隆抗體藥物進展.藥物生物技術(shù),2005,12(4):270-274.2李志勇細胞工程M.北京科學出版社,2003:3-21.3李紅艷,徐梅,向青,等.空間誘變致生長減慢 CHO(dhfr 一)細胞株的特性.中國康復理論與實,10(11):647-648.4

21、趙瑋,戴長柏,孫茂盛.紅細胞生成素（E P O ）在中國倉鼠卵巢細胞（C H O ）中穩(wěn)定表達.云南大學學報.1999,21(3):175-178.5孟宗達,韓秀蘭,林惠芳,.我國研制的乙型肝炎基因重組（C H O ）疫苗對乙型肝炎病毒母嬰傳播阻斷效果觀察.中國計劃免疫.2001,7(2):94-95.6Kohler G, Milstein C. Continuouscultures of fused cells secreting anti-body of predefined specificityJ.Nature,1975,256(5517):495-497.7李剛,劉鵬,劉誠迅,等。我

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