齊魯醫(yī)學基因克隆的酶學基礎

1、第三章 基因克隆的酶學基礎2021/9/301限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3- 5磷酸二酯鍵DNA聚合酶探針標記、補平3末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探針標記末端轉(zhuǎn)移酶3末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶：2021/9/302第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶第二節(jié) DNA連接酶第三節(jié) DNA聚合酶第四節(jié) DNA及RNA的修飾酶第五節(jié) 核酸外切酶第六節(jié) 單鏈核酸內(nèi)切酶2021/9/303一、寄主控制的限制與修飾二、型限制酶的特點三、影響內(nèi)切酶活力的因素四、核酸內(nèi)切酶對DNA的消化作用五、 限制酶的用途第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體外切割2021/9/

2、304一、寄主控制的限制與修飾人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡稱（R/M體系）。細菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解掉。 2021/9/305限制與修飾系統(tǒng)是細胞的一種防衛(wèi)手段。 各種細菌都能合成一種或幾種能夠切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶，它們以此來限制外源DNA存在于自身細胞內(nèi)，但合成這種酶的細胞自身的DNA不受影響，因為這種細胞還合成了一種修飾酶，對自身的DNA進行了修飾，限制性酶對修飾過的DNA不能起作用。2021/9/306修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶2021/9/307作 用：保護自身DNA不受限制；

3、破壞外源DNA使之降解2021/9/308 E.coli B含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶當(k)噬菌體侵染E.coliB時，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識別的堿基序列，被降解掉。而E.coli B的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能識別已甲基化的序列。2021/9/309數(shù)字表示在不同寄主中生長的噬菌體的成斑率，表示限制程度。2021/9/3010二限制和修飾作用的分子機制1大腸桿菌宿主細胞 K株，B 株 ，有各自的限制和修飾系統(tǒng)。1）它們均有三個連續(xù)的

4、基因位點控制，hsdR; hsdM; hsdS.2）hsdR編碼限制性核酸內(nèi)切酶-識別DNA分子特定位點，將雙鏈DNA切斷。（DNA分子轉(zhuǎn)化細胞：受體細胞去掉hsdR基因位點）3）hsdM編碼產(chǎn)物是DNA甲基化酶-催化DNA分子特定位點的堿基甲基化反應。4） hsdS表達產(chǎn)物的功能是-協(xié)助限制性核酸內(nèi)切酶和甲基化酶，識別特殊的作用位點。2021/9/3011限制性內(nèi)切酶本是微生物細胞中用于專門水解外源DNA的一類酶，其功能是避免外源DNA的干擾或噬菌體的感染，是細胞中的一種防御機制。由于R/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶。根據(jù)酶的功能、大小和反應條件，及切割DNA的特點，可

5、以將限制性內(nèi)切酶分為三類： 型酶、型酶、 型酶2、限制性內(nèi)切酶的類型2021/9/3012（1）型酶： 1968年，M. Meselson和R. Yuan在E. coli B和E. coli K中分離出的核酸內(nèi)切酶。 分子量較大，反應需Mg2+、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。 這類酶有特異的識別位點但沒有特異的切割位點，而且切割是隨機的，所以在基因工程中應用不大。 2021/9/3013（2）型酶 1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血菌Rd株中分離出來的限制酶。分子量較?。?05 Da），只有一種多肽，通常以同源二聚體的形式存在。2021/9/3014

6、 反應只需Mg2+的存在，并且具有以下兩個特點，識別位點是一個回文對稱結(jié)構(gòu)，并且切割位點也在這一回文對稱結(jié)構(gòu)上。 許多型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重組。2021/9/3015（3）型酶這類酶可識別特定堿基順序，并在這一順序的3端2426bp處切開DNA，所以它的切割位點也是沒有特異性的。 2021/9/3016二、限制性內(nèi)切酶的特點1、定義、命名 （1）定義廣義指上述三個系統(tǒng)中的限制酶； 狹義指II型限制酶。 （2）命名限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、分離順序。例如：Hind前三個字母來自于菌種名稱H. influenzae，“d”表示菌系為d型血清型

7、（菌株號）；“”表示分離到的第三個限制酶。EcoRIEscherichia coli RI 2021/9/30172、限制酶的特點（1）基本特點在DNA雙鏈的特異性識別序列部位，切割DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂。兩個單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對的因此，斷裂的結(jié)果形成的DNA片斷，也往往具有互補的單鏈延伸末端。2021/9/3018 （2）識別順序和酶切位點 識別-8個相連的核苷酸 Mbo I NGATCN Ava II GG(A/T)CC BamH I GGATCC PpuM I PuGG(A/T)CCPy 2021/9/30192021/9/3020 估算RE識別序列在

8、DNA上出現(xiàn)的頻率:識別序列的頻率=1/4n Sau3A (4bp)=1/44 256bp EcoR I、Pst I (6bp)=1/46 4096 Not I (8bp)= 1/48 65536 (rare cutters) 僅是理論推測2021/9/3021 對稱性 限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是5-P和3-OH EcoRI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5 2021/9/3022（3）末端種類 3-端突起，個數(shù)為2或4個核苷酸Pst I 5-CTGCAG-3 5-CTGCA G-3 3-GACGTC-5 3-G ACGTC-5 5-端突起，個數(shù)為2或4個

9、核苷酸 EcoRI 5-GAATTC-3 5-G AATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5 2021/9/3023平齊末端SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5 非互補的粘性末端切點在識別順序之外的，如：FokI Fok I 5-GGATG()9-3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC()13-5 3-CCTAC(N)13能識別簡并順序的，如：AvaI AvaI 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG、CTCGGG、CCCGA、CTCGAG 2021/9/30245粘性末端 3粘性末端平頭末端2021/9/3

10、025（4）異源同序酶（isoschizomer，同裂酶） 定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶 特點：識別相同順序切割形成相同的末端 KpnI GGTACC SstI CCGCGG Asp718 GGTACC SacI CCGCGG 2021/9/3026例：限制酶HpaII和MspI共同的靶序列CCGG2021/9/3027（5）同尾酶（isocaudamer）例：BamHI和BglBamHIG GATCCCCTAG GGGATCCCCTAGGBglA GATCCCCTAG AAGATCCCCTAGA來源各異，識別的靶序列不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端2021/9/3028（6）限

11、制片段末端的連接作用 分子間連接分子間連接：不同的DNA片段通過互補的粘性末端之間的堿基配對而彼此連接起來。2021/9/3029分子內(nèi)連接：同一片段的2個互補末端之間的堿基配對而形成的環(huán)行分子。返回2021/9/3030三、影響內(nèi)切酶活力的因素（1）DNA的純度污染的蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高濃度的鹽離子等都有可能抑制核酸內(nèi)切酶活力。提高效率的方法： 增加核酸內(nèi)切酶的用量 擴大反應體積，使?jié)撛谝蛩乇幌♂?延長酶催化時間2021/9/3031（2）DNA的甲基化程度基因克隆中采用失去甲基化酶的大腸桿菌菌株制備質(zhì)粒DNA。 應用：利用核酸內(nèi)切酶對甲基化序列的敏感性檢測序列中的

12、甲基化位點2021/9/3032（3）酶切消化的反應溫度大多數(shù)核酸內(nèi)切酶的反應溫度在37，有些酶例外。（表 3-7）酶活力單位： 一個活性單位（U），是指在50l反應體系中，37oC的條件下，經(jīng)過1小時的反應時間，將1g DNA 完全酶解所需要的酶量。2021/9/3033（4）DNA的分子結(jié)構(gòu)DNA分子的不同結(jié)構(gòu)對核酸內(nèi)切酶的活性有很大影響：例如: 切割超螺旋的或病毒DNA比線性的酶用量高出很多倍； 切割不同位點的序列效率會有差異；可能是由于側(cè)翼序列的影響對于局部消化時要考慮到不同位點的切割效率2021/9/3034（5）核酸內(nèi)切酶的緩沖液（-20保存）主要成分： 氯化鎂、氯化鈉、氯化鉀，T

13、ris-HCl，-巰基乙醇，二硫蘇糖醇（DTT）Mg2：酶發(fā)揮活性必需，不正確的Mg2和NaCl會影響對特異序列的識別。Tris-HCl：保證酶反應的pH，一般在pH 7.4條件下功能最佳巰基乙醇：保持某些酶的穩(wěn)定性2021/9/3035非最適條件下酶的識別序列會發(fā)生變化：高濃度的酶，高濃度的甘油、低離子強度、高pH，用Mn2代替Mg2等甘油的影響（星號活性）例：EcoR在正常情況下識別GAATTC，但是如果甘油濃度超過5（V/V），識別序列發(fā)生變化，可在AATT或PuPuATPyPy序列處發(fā)生切割。返回2021/9/3036四、核酸內(nèi)切酶對DNA的消化作用完全酶切消化： 例如識別6個堿基的酶

14、，可以每隔464096切割一次。切割達到了這樣的片段化水平，為限制酶對DNA分子切割完全。局部酶切消化 使酶切反應不進行完全，可以通過縮短反應時間，減少酶的用量，降低反應溫度等方法約束酶活性。2021/9/3037五、 限制酶的用途DNA重組限制酶（物理）圖譜繪制 突變分析（RFLP分析）限制酶的部分酶切與完全酶切2021/9/3038酶切圖譜的構(gòu)建2021/9/30392021/9/30402021/9/3041例1：限制性消化反應體系。 總體積是30L。 5L質(zhì)粒DNA 1L EcoRI 1L XbaI 3L 10RE緩沖液 20L水 2021/9/3042例2：畫一張與這些結(jié)果一致的示意

15、圖，確切地標明所有限制性酶的酶切位點及它們之間的距離，包含下列所有的信息： （1）限制性酶位點之間要有合適的距離（例如：EcoRI-BamHI = 3.3 kb） （2）在你的圖中央標明質(zhì)粒的總大小。 （3）限制性酶的位點應在與它彼此相對應的正確位置上標明。2021/9/3043BamH：得到3.3和3.7kbEcoR：得到5和2kb BamH和EcoR：得到3.3，1.7，1.5，0.5kb2021/9/30443.3kb2kbEcoRBamH5kb1.7kb1.5kb0.5kb2021/9/3045酶切反應注意事項價格昂貴決不能用水稀釋，以免變性失活。預先加入除酶以外的所有其他試劑。取酶立

16、即放于冰上。分裝小份避免反復凍融。使用無菌的新吸頭。少加水，使體積最小，但保證酶液體積不超過總體積的10，否則酶液中的甘油會抑制酶活性。 返回2021/9/3046一、DNA連接酶的種類及反應條件二、反應機理三、粘性末端DAN片斷的連接四、平末端的連接（1）銜接物連接法（2）DNA接頭連接法（3）同聚物加尾連接法五、熱穩(wěn)定的連接 第二節(jié) DNA連接酶和DNA分子的體外連接2021/9/3047能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3-羥基（OH）和5-磷酸基團（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。只能連接切口（nick），不能連接缺口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分

17、子的一部分。2021/9/3048ds DNA結(jié)構(gòu): 切口， 缺口，斷口缺口(gap) 切口(nick) 斷口(cut)3HO P53HO P52021/9/3049nicknick2021/9/30502021/9/3051一、連接酶的來源1、DNA連接酶大腸桿菌染色體編碼的 2、T4 DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的 DNA連接酶 NAD+ T4 DNA連接酶 ATP2021/9/3052從T4噬菌體的受感染細胞中提取，是由T4噬菌體基因組所編碼。特點： 只連接ds DNA分子，要求3-羥基和5-磷酸基 用途： 1) 相同或相容粘性末端的連接 2) 平整末端的相連 DNA平端來源

18、：限制酶作用結(jié)果; 限制酶與其它酶共同作用結(jié)果。平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多。 返回2021/9/3053DNA的腺苷酸復合物3-OH對P原子作親核攻擊 形成磷酸二酯鍵此反應是由焦磷酸 (ppi)的水解作用激發(fā)的需要花費兩個高能磷酸鍵（賴氨酸殘基）二、反應機理返回2021/9/3054 三、粘性末端DAN片斷的連接 由于具粘性末端的載體易發(fā)生自連。 對載體的5末端進行處理，用細菌的或小牛腸的堿性磷酸酶移去磷酸基團，使載體不能自連。而外源片斷的5-P能與載體的3-OH進行共價鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個連接位點中載體DNA只有一條鏈與外源片斷相連，失去5-P的鏈

19、不能進行連接，形成3-OH 和5- OH 的缺口。 2021/9/3055返回2021/9/3056 四、平末端DNA片斷的連接T4 DNA連接酶用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端修飾之后，再用DNA連接酶連接。常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法2021/9/3057 1、同聚物加尾法用5 末端特異的核酸外切酶處理DNA片斷在A和B分別中加入dATP和dTTP，末端轉(zhuǎn)移酶加上同聚物尾巴1040個堿基Klenow酶補平末端2021/9/30582、銜接物連接法 平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進行處理，人工加上粘性末端。 銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約1020個

20、核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點的回文結(jié)構(gòu)。 Hpa IIBamH ICCGGATCCGG GGCCTAGGCC Hpa II2021/9/3059將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。 這種方法的優(yōu)點是克隆位點具有限制酶的酶切位點。2021/9/3060銜接物連接法2021/9/3061 銜接物（linker）是指用化學方法合成的一段由1012個核苷酸組成、具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。 雙銜接物：可以實現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時對克隆片斷的再刪除也比較方便。2021/9/3062雙銜接物連接法的

21、基本程序cDNA鏈的合成通過DNA聚合酶合成第二鏈加入Sal I銜接物2021/9/3063S I核酸酶作用后的末端單鏈突出序列，由Klenow補齊，加入第二銜接物EcoR I2021/9/3064 在用DNA銜接物連接法時，如果待克隆DNA的片斷或基因內(nèi)部，含有與所加銜接物相同的限制位點，在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時，也會把克隆的基因切斷。2021/9/30653、DNA接頭（adapter）連接法1978年，美國康奈爾大學生化分子生物學系的教授吳瑞博士發(fā)明的。是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。GGATCCCCTAGGG GATCCCC

22、TAG G2021/9/3066粘性末端容易通過堿基配對形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對DNA接頭分子末端，進行必要的修飾。移走粘性末端5-P，暴露出5-OH，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。2021/9/3067DNA接頭連接法返回2021/9/3068五、熱穩(wěn)定的連接 從嗜熱高溫放線菌的菌株中分離出來的。能在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接用的一種核酸酶。使用這種連接酶進行體外連接，可以明顯降低形成非特異性連接產(chǎn)物的機率（1）寡核苷酸連接測定 （oligonucletide ligation assay, OLA） 用兩個寡核苷酸探針（2025bp），同已知序列靶DNA雜交，探針在靶DNA分

23、子的位置是相鄰的。 2021/9/3069待擴增的DNA片斷PPBBDD地高辛配基生物素磷酸BBBBDDPP陽性信號無信號鏈霉抗生物素蛋白由于堿基錯配不能形成磷酸二酯鍵檢測單堿基的取代、插入、及缺失而引起的多態(tài)性AGTGACCT TCACTGGABA G T GA C C TA G TTA C C TA C C TA C C TA G T G A C C TA G T G A C C T偶聯(lián)堿性磷酸酶的抗地高辛抗體53洗滌后加入堿性磷酸酶底物2021/9/3070（2）連接酶鏈式反應（ligase chain reaction, LCR）也叫連接擴增反應（ ligase amplication

24、 reaction），用寡核苷酸探針通過DNA連接酶的作用擴增已知序列的靶DNA的方法。需要4種引物。2021/9/3071樣品DNA、4種極大超量的探針、NAD，pH7.8混合94變性55退火，使探針與模板雜交DNA連接酶連接熱穩(wěn)定的DNA連接酶連接熱穩(wěn)定的DNA連接酶連接2021/9/3072 裂口連接酶鏈式反應（G-LCR）連接酶鏈式反應中存在獨立于靶DNA的連接作用G-LCR可以避免獨立于靶DNA的連接作用，從而使敏感性大大提高寡核苷酸探針已經(jīng)被修飾過，具有交錯末端退火后兩個探針間用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶補齊后連接。2021/9/3073 不對稱裂口連接酶鏈式反應（AG-LCR）可用于檢

25、測RNA分子RNA4探針4、熱敏感的反轉(zhuǎn)錄酶、三種dNTPRNA4432132聚合酶連接酶1探針4發(fā)生延伸反應，到混合物中沒有補充所需的dNTP反應終止，延伸了9-15個核苷酸探針1與探針2雜交，發(fā)生延伸反應返回2021/9/3074 五、影響連接酶作用的因素1、反應溫度連接缺口的溫度：37，但是粘性末端的氫鍵不穩(wěn)定連接粘性末端的最佳溫度： 4162、T4 DNA連接酶的用量平末端DNA分子的連接反應中，最適12個單位。粘性末端DNA片斷之間的連接，酶濃度0.1個單位。 ATP的用量10mol1mmol/L之間3、提高外源片斷與載體的濃度的比值，（310倍）返回2021/9/3075 常用的D

26、NA聚合酶 大腸桿菌DNA聚合酶 大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow大片段 T4 DNA聚合酶 反轉(zhuǎn)錄酶 T7 DNA聚合酶 第三節(jié) DNA聚合酶2021/9/3076一、E.coli 的DNA聚合酶系統(tǒng)pol I 參與DNA修復，具35和53外切酶活性pol II 參與DNA修復，具35外切酶活性pol III參與DNA復制，具35和53外切酶活性2021/9/30771957年，美國的生物學家A. Kornberg首次證實，在大腸桿菌提取物中存在一種DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說的DNA聚合酶。由pol基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，分子量為109103dal。（一）DNA聚合酶 I（Pol I）

27、2021/9/30781、E.coli Pol I的特點（1）具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具35外切酶活性和聚合酶活性（大片段亦稱為Klenow片段）。（2）聚合酶活性 53, 要求3-OH引物和模板DNA，其延續(xù)性受反應條件的影響2021/9/3079（3） DNA聚合酶發(fā)揮作用的條件：底物：四種脫氧核苷5-三磷酸（dNTP）；Mg2離子；帶有3-OH游離基團的引物鏈；DNA模板：單鏈，雙鏈（糖-磷酸主鍵上有一個或多個斷裂）。 2021/9/30802021/9/308153外切酶活性2021/9/308

28、2 DNA聚合酶的35核酸外切酶活性 能催化DNA鏈發(fā)生水解作用，從DNA鏈3-OH末端開始向5方向水解DNA，并釋放出單核苷酸分子。 對酶活的影響： 反應物中缺乏dNTPs時，大腸桿菌DNA聚合酶的35核酸外切酶活性，將會發(fā)揮作用。但對于底物是雙鏈的DNA，在具有dNTPs時，這種降解活性將會被53的聚合酶活性所抑制。 2021/9/30832021/9/30842、DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途除去3-端突起的單鏈DNA（在無dNTP時）補齊5-突起端（常用Klenow大片段）合成第二條cDNA（常用Klenow大片段）切口移位制備探針2021/9/3085（1）通過DNA缺口轉(zhuǎn)移，制

29、備供核酸分子雜交用的帶放射性標記的DNA探針。DNA切口平移（nick translation）2021/9/3086缺口雙鏈鏈的取代缺口轉(zhuǎn)移在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶的53核酸外切酶活性和聚合作用可以同時發(fā)生。當外切酶活性從缺口的5一側(cè)移去一個5核苷酸之后，聚合酶作用就會在缺口的3一側(cè)補上一個新的核苷酸，但Pol不能在3-OH和5-P之間形成磷酸二酯鍵，隨著5一側(cè)的核苷酸不斷移去，3一側(cè)的核苷酸又按序列增補，缺口沿著DNA分子合成的方向移動。2021/9/3087DNA雜交探針的制備 典型的反應體系：純化的特定DNA片斷，適量DNase、Pol、-32p-dNTPs和未標記的dN

30、TPs。 DNase：造成DNA分子的斷裂或缺口； Pol：進行切口轉(zhuǎn)移，使反應混合物中的32p標記的核苷酸取代原有的未標記的核苷酸，最終從頭到尾都被標記。2021/9/3088Dnase作用形成單鏈切口Pol的53外切活力從5切去核苷酸5355535Pol的53聚合酶活力在3加上放射性標記的核苷酸Dnase作用形成單鏈切口Pol的53外切活力從5切去核苷酸5355535Pol的53聚合酶活力在3加上放射性標記的核苷酸2021/9/3089 dNTP 對Pol酶活性的影響在低濃度dNTPs的條件下，Pol具有良好的活性，提高dNTPs濃度時， Pol則能夠更有效的合成DNA。低濃度的 32p-

31、dNTPs（2mol/L）和高濃度的dNTPs（20mol/L ）一般希望有30%左右的32p-dNTPs參入DNA鏈（ Dnase數(shù)量）。 2021/9/3090 （二）Klenow片段與DNA末端標記Klenow片段 由大腸桿菌DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產(chǎn)生出來的分子量為76103dal的大片斷分子。仍具有53的聚合酶活性和35 的外切酶活性，失去了全酶的53外切酶活性。 2021/9/3091Klenow片段的主要用途 1、修補經(jīng)限制酶消化的DNA所形成的3隱蔽末端； 2、標記DNA片斷的末端； 3、cDNA克隆的第二鏈cDNA的合成； 4、DNA序列的測定。2021/9/

32、3092DNA片段末端標記 具有 3隱蔽末端的帶標記得的DNA片斷 5GATCT3 3 A5 在反應物中加入Klenow聚合酶-32p-dGTP，一道溫育后生成： 5GATCT3 3 *GA5 或是同時加入-32p-dATP dGTP 5GATCT3 3 *AGA52021/9/3093DNA片斷末端標記可以作為用凝膠電泳法測定分子大小的標記樣品。因為被標記的DNA片斷是同它們的摩爾濃度成比例，而與他們的分子大小無關(guān)。所以在限制酶消化過程產(chǎn)生的大小DNA片斷都得到了同等程度的標記。不能有效的標記帶有5突出末端DNA分子。返回2021/9/3094二、T4 DNA聚合酶1、從T4噬菌體感染的大腸

33、桿菌培養(yǎng)物中純化出的一種特殊的DNA聚合酶，具有53的聚合酶活性和35外切酶活性。53聚合酶活性，1500 nt/min, 為Pol I的兩倍35外切酶活性，可作用于ss DNA和ds DNA，其切除速度分別為40和 4000nt/min2021/9/30952、在沒有脫氧核苷三磷酸存在的情況下，3外切酶活性便是T4 DNA聚合酶的獨特功能。作用于雙鏈DNA片斷，并按35的方向從3-OH末端開始降解DNA。如果反應物中存在一種dNTP時，它的水解作用進行到暴露出同反應物中唯一的dNTP互補的核苷酸時就會停止。 外切酶活性 聚合酶活性 無dNTP dNTP2021/9/30963、取代合成法標記

34、DNA片斷在反應過程中，通過T4 DNA聚合作用，反應物中的-32p-dNTP逐漸地取代了被外切活性刪除掉的DNA片斷上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。3外切酶活力可以切割ds DNA和ss DNA，ds DNAss DNA，要控制降解時間。對DNA分子3端有控制的降解返回2021/9/3097三、反轉(zhuǎn)錄酶1、來源許多RNA腫瘤病毒中分離到這種酶，最常用的是來源于鳥類骨髓母細胞瘤病毒的反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）2、特點AMV具有鏈和鏈鏈具有聚合酶活性和RNase H活性鏈具有以RNA-DNA雜交分子為底物的53脫氧核酸外切酶活性2021/9/3098聚合酶活性2021/9/3099 RNase H活性

35、：從53或者35方向特異的降解RNA-DNA中的RNA鏈2021/9/301003、主要作用以mRNA為模板合成cDNA；用來對5突出末端的DNA片斷作末端標記。返回2021/9/30101四、T7 DNA聚合酶1978年，S. Tabor從感染了T7噬菌體的大腸桿菌寄主細胞中純化出來的一種核酸酶。加工形式的T7 DNA聚合酶系：T7噬菌體編碼的基因5蛋白質(zhì)，另一種是大腸桿菌編碼的硫氧還蛋白?；?蛋白質(zhì)：具有聚合酶活性和35外切酶活性；硫氧還蛋白：增強基因5蛋白質(zhì)與模板引物的結(jié)合力具有53的聚合酶活性和很高的單鏈及雙鏈的3 5核酸外切酶活性。2021/9/30102 T7 DNA聚合酶的用途

36、 1、用于對大分子量模板的延伸合成；（不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響，聚合能力較強可延伸合成數(shù)千個核苷酸） 2、通過延伸或取代合成法標記DNA3末端； 3、將雙鏈DNA的5或3突出末端轉(zhuǎn)變成平末端的結(jié)構(gòu)。2021/9/30103修飾的T7 DNA聚合酶 對天然的T7DNA聚合酶進行修飾，使之完全失去35的外切酶活性。聚合作用的速率增加了3倍。用途： 1、作為一種DNA序列分析的工具酶：加工性能高；無35外切酶活性；具有催化脫氧核糖類似物聚合的能力。 2、制備探針；可催化較低水平的dNTP（ATG 反應產(chǎn)物：5-單磷酸核苷和具缺口或5-端突起的ds-DNA，過渡反應將導致DNA降解2021/9/301

37、18（2）核酸酶H活性：除去DNA-RNA雜交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5（3）3-磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成3-OH端，有利于DNA聚合酶反應，pH 6.8-7.4（4）內(nèi)切酶活性：在無嘌呤或無嘧啶處將DNA鍵切開，pH 7.6-8.53HOP5P53HORNase H2021/9/301193、用途 （1）核酸（DNA）標記配合使用klenow酶 ExoIII ExoIII -32P -32P dCTP dCTP 5PP55PP53HOOH33HOOH3Exo III用于DNA標記2021/9/30120（2）基因突變-缺失（3）DNA序列測定時作順序缺失1 2 3 4

38、a b c1 2 3 4 a b c1 2 3 4 a b c1 2 3 4 a b c1 2 3 4 a b c 2 3 4 a b c 3 4 a b c 4 a b c a b cExoIII用于順序缺失ExoIII優(yōu)先降解3端隱蔽的末端exo降解5突出端S2021/9/301214、使用注意事項正式使用前，測定在一定條件下酶的反應速度在一定條件下，ExoIII不能作用GC富集區(qū)（來自于cDNA加尾）2021/9/30122（二）噬菌體核酸外切酶（exo）T7噬菌體基因6核酸外切酶ds DNA1、exo（1）來源：從感染了噬菌體的大腸桿菌中純化而來（2）特點：催化雙鏈DNA自5-P末端進行逐步的加工水解，釋放出5單核苷酸，但不降解5-OH5P5P3HO3HOOH3OH 3P 5P 52021/9/30123（3）用途將雙鏈變?yōu)閱捂?，供雙脫氧測序分析從DNA中移去5突出端，以便用末端轉(zhuǎn)移酶進行加尾2021/9/301242、 T7噬菌體基因6核酸外切酶（1）來源大腸桿菌T7噬菌體基因6編碼的產(chǎn)物（2）特點自5-OH和5-P末端移去核苷酸，其活性比 exo低，主要用于從5端開始的有控制的勻速降解。2021/9/30125三、大腸桿菌外切酶（exo）ss DNA（1）特點：單鏈核酸外切酶，