離子通道課件

1、植物細胞離子通道植物細胞膜系統(tǒng)和離子通道膜片鉗技術簡述 植物根系不僅從土壤中吸收水分，還要吸收各種礦質元素，以維持正常的生命活動，促進植物的生長發(fā)育目的獲得高產(chǎn)優(yōu)質如：小麥、水稻、玉米、煙草、蔬菜、水果等植物吸收礦質元素首先細胞從環(huán)境中吸收，這個環(huán)境可以是植物的生存外部環(huán)境，如土壤，也以是植物本身的內(nèi)部環(huán)境肥料離子吸附交換細胞被動吸收：外液濃度細胞濃度 吸收主動吸收：外液濃度細胞濃度 吸收 積累離子 被動吸收：擴散作用：指分子或離子沿著化學勢梯度或電化學勢梯度轉移的現(xiàn)象 楞思特方程式： 協(xié)助擴散：指小分子物資經(jīng)膜轉運蛋白順濃度梯度或電化學勢梯度的轉運轉運蛋白：膜上具有轉運功能的蛋白質又稱傳遞蛋

2、白分為二類：載體蛋白 通道蛋白載體蛋白：是一類內(nèi)部蛋白，由載體蛋白轉運的物質首先與載體蛋白的活性部位結合，結合后載體蛋白發(fā)生構象變化，被轉運的物質釋放到細胞內(nèi)。載體蛋白轉運物質具有飽和現(xiàn)象。通道蛋白：由細胞膜中一類內(nèi)部蛋白構成的孔道，或有的稱膜中由大分子組成的孔道又叫離子通道。可被化學方式或電化學方式激活，控制離子順勢流過細胞膜，在形成維持跨膜離子梯度和信號傳導等生理過程起重要作用。檢測：膜片鉗技術取幾平方微米細胞膜或者全細胞膜，測定跨膜離子電流的大小，即在保持跨膜電壓恒定的條件下，測定通過膜上離子通道的離子流大小。其原理，歐姆定律 ： 分析膜上的離子通道，細胞間的離子運輸，氣孔運動，光受體，

3、激素受體，及信號傳導，廣泛應用。植物細胞特點細胞壁 液泡 葉綠體 植物細胞膜系統(tǒng)和離子通道植物細胞膜系統(tǒng)和離子通道植物吸收離子涉及到質膜上的轉運蛋白。膜轉運蛋白分為兩類：載體蛋白也稱載體或轉運體。它與特定的離子結合，發(fā)生構象變化，把離子轉運過膜。通道蛋白也稱離子通道是由膜中大分子組成的孔道或是由膜中一類內(nèi)在蛋白組成的孔道。當這些通道打開時，準許特定的離子跨膜通過。植物離子通道的概念植物細胞膜系統(tǒng)和離子通道1. 離子轉運的被動性2. 離子的選擇性和導度(離子導度：離子跨暯的能力，電阻的倒數(shù)，反應通過離子通道通過離子多少。 )3. 通道門控特性4. 離子轉運的高效性5. 飽和現(xiàn)象 （離子跨膜運輸可

4、 分 為被動運輸和主動運輸兩類。由 擴散作用或物理 過程所決定的運輸屬于被動運輸；逆濃度梯度或電位梯度 運輸 ，需要消耗能量屬于主動運輸。離子通道 與載體蛋白都能準許離子沿濃度梯度或電勢梯度擴散，但二者的轉運離子的速度有明顯差異。載體蛋白每秒可轉運104-105個離子，轉運效率低，而離子通道秒可轉運106-107個離子，高出1001000倍，轉運效率高。原因：經(jīng)載體蛋白轉運離子需要與特定的離子結合，結合的部位數(shù)量有限，具有飽和現(xiàn)象，而離子通道則沒有。）植物離子通道的特點根據(jù)生物學功能的特性將離子通道分為三類: ( 1) 電壓門控的離子通道,包括Na+、K+、Ca2+ 通道等; ( 2) 受體激

5、活的離子通道, 包括神經(jīng)遞質、激素等外源性化學物質以及機械和滲透壓力刺激所激活的離子通道; ( 3) 第二信使激活的離子通道, 包括由細胞內(nèi)Ca2+、IP3、G 蛋白及蛋白激酶激活的離子通道。植物細胞膜系統(tǒng)和離子通道植物細胞離子通道類型自從在蠶豆保衛(wèi)細胞膜上發(fā)現(xiàn)植物離子通道以來，人們對植物細胞乃至作為細胞器的液泡膜上離子通道的認識迅速深入,到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)植物細胞及其內(nèi)膜上存在多種離子通道。陰離子通道陽離子通道植物細胞離子通道質膜上的離子通道其他細胞器膜上的離子通道液泡膜上的離子通道植物細胞膜系統(tǒng)和離子通道植物質膜上的離子通道植物細胞膜系統(tǒng)和離子通道陰離子通道K+通道內(nèi)向整流通道 : K+

6、in外向整流通道 ：K+outCa2+通道Cl- , NO3-內(nèi)向型K+通道AKT1結構模型示意圖植物細胞膜系統(tǒng)和離子通道 具有6個保守的跨膜結構域，其中S4結構域具有電壓感應作用，S5與S6之間有一個形狀如發(fā)卡的疏水區(qū)域，這個結構區(qū)域構成離子通道的孔道部分，具有結合離子的位點。鈣離子通道調節(jié)細胞生理活動的模型植物細胞膜系統(tǒng)和離子通道離子通道與細胞信號轉導保衛(wèi)細胞離子通道參與了ABA信號轉導過程植物細胞膜系統(tǒng)和離子通道離子通道分子水平的研究概況 KATI：從擬南芥中鑒定出來的鉀離子運輸?shù)鞍?，是電壓依賴型?nèi)向性通道，在擬南芥保衛(wèi)細胞和莖根的維管組織中表達，參與氣孔開發(fā)，并向維管組織中轉運鉀離子，

7、不能從土壤中吸收鉀離子。擬南芥中的KATI可編碼667個AA, 分子量為79KD. AKTI：從效母突變體中采用互補法篩選出來。在根組織中表達，能從土壤 中吸收鉀離子，可編碼856個AA, 分子量為97KD. 這兩個基因已導入水稻和煙草,具有較強吸收鉀離子能力. KCOI：從擬南芥數(shù)據(jù)庫中篩選出來的外向型鉀離子通道，轉運鉀離子時依賴胞質中鈣離子，在植物各個部位均有表達，在亞細胞水平上在液泡暯上。 LKTI：從西紅柿根毛特化的cDNA 庫克隆出來，LKTI 的 m RNA 在 根中表達。 ZMK1 和 ZMK2：從玉米胚芽鞘中分離的鉀離子通道基因，ZMK1在外部酸性化時激活 Kin通道，ZMK2

8、電壓依賴型。 TaAKTI：從小麥根中分離的，具有與擬南芥KATI氨基酸順序76%，屬于Kin通道。AtKUPI： 該基因是通過校母突變體 互補性分析得到的，呈現(xiàn) “兩相”形式，從高親和相Km 為44M性到低親合相Km值為11mM性的轉變范圍在100200M外界鉀離子濃度.高低和 親系統(tǒng)受到5mM 和更高濃度的抑制.也受到鉀離子通道阻斷劑的抑制,在根中表達,不同鉀含量的土壤中吸收鉀.木質部壁細胞含有3個陽離子通道： KORC： 為外向型鉀離子通道, 調節(jié)鉀從木質部壁細胞釋放到導管中. KIRC：為內(nèi)向型鉀離子通道,調節(jié)鉀從木質部轉移到周圍壁細胞重新吸收 NORC： 非選擇性外向整流陽離子通道，

9、能把鹽分釋放到木質部的導管，還負責電信號和水力學信號的傳導。 離子通道問題和展望 生理作用調控的分子機理基因的轉化和應用膜片鉗技術由來電壓鉗技術示意圖電壓鉗技術是通過向細胞內(nèi)注射一定的電流, 抵消離子通道開放時所產(chǎn)生的離子流, 從而使細胞膜電位固定在某一數(shù)值. 由于注射的電流與離子流大小相等、方向相反, 因此它可以反映離子流的大小和方向. 電壓鉗技術是一種研究可興奮細胞電生理特征的基本手段和方法, 但在應用上具有其局限性: 1) 雙微電極鉗位法只適用于巨大的神經(jīng)軸突、肌肉纖維和卵母細胞等較大的細胞, 對于直徑小于10 微米的細胞, 胞內(nèi)插入兩根電極就很困難, 雖然此時可用單根吸附電極進行電壓鉗

10、位, 但是對細胞膜的損傷也不可避免; 2) 只能采用全細胞記錄模式, 記錄到的是整個細胞膜上所有開放通道的電流總和, 無法了解單通道電流的情況; 3) 由于電壓鉗微電極尖端很細( 電阻大) , 會影響記錄電流的能力。膜片鉗技術簡述膜片鉗技術原理膜片鉗技術是用微玻管電極膜片電極或膜片吸管接觸細胞膜, 以千兆歐姆以上的阻抗使之封接, 使與電極尖開口處相接的細胞膜的小區(qū)域膜片與其周圍在電學上分隔, 在此基礎上固定電位, 對此膜片上的離子通道的離子電流（pA級）進行監(jiān)測記錄的方法.膜片鉗技術簡述全細胞鉀離子通道電流單通道記錄鈣離子通道電流膜片鉗技術簡述膜片鉗（儀器）拋光儀拉制儀顯微鏡操作系統(tǒng)及可見光源

11、膜片鉗技術簡述低溫水浴搖床膜片鉗技術簡述材料的好壞直接影響膜片鉗實驗的成敗！要根據(jù)不同的實驗目的來栽培材料。根細胞：通常根長度在2厘米左右，但突變體要根據(jù)該基因起作用的發(fā)育階段來確定；保衛(wèi)細胞：通常在土壤中生長4-6周，但絕不能抽苔；葉肉細胞對光照要求較高，因為光照直接影響葉綠體的活動。膜片鉗技術步驟膜片鉗技術簡述實驗試劑蠶豆保衛(wèi)細胞鉀通道實驗溶液（1）基本緩沖液：KCl 50mmol/L、Mes 10mmol/L、pH6.1(KOH)（2）基本介質：甘露醇0.45mol/L、CaCl2 0.5mmol/L、MgCl2 0.5mmol/L、抗壞血酸 0.5mmol/L、KH2PO4 10mol

12、/L、Mes 10mmol/L、pH5.5(KOH)。（3）第一酶液：Cellulysin 0.7%、PVP-40 0.1%、牛血清白蛋白（BSA）0.25%，溶于45%的基本介質中。（4）第二酶液：Cellulase RS 1.2%、Pectolyase Y-23 0.01%、BSA 0.25%、抗壞血酸 0.5mmol/L，溶于45%的基本介質中。（5）細胞外液：谷氨酸鉀 10mmol/L、MgCl2 2mmol/L、CaCl2 1mmol/L、KOH 1mmol/L、Mes 10mmol/L、pH5.5(KOH)，用甘露醇調節(jié)滲透壓為460mOmol/Kg。（6）電極溶液：谷氨酸鉀 10

13、0mmol/L、MgCl2 2mmol/L、KOH 4mmol/L、MgATP 1.1mmol/L、CaCl2 0.1mmol/L、Hepes 10mmol/L、pH7.2 (KOH), 用甘露醇調節(jié)滲透壓為510mOmol/Kg。 膜片鉗技術簡述（1）在28、60轉/分的搖床上用酶解液解離0.5-2小時左右，根據(jù)不同消化時間的細胞狀態(tài)判斷消化程度，在顯微鏡下清晰地看到游離 細胞。（2）用200目尼龍網(wǎng)過濾，基本介質沖洗后60g離心7-10分鐘，棄去上清液，再用50基本介質洗滌2-3次，最后將原生質懸浮于溶液中，04靜置恢復。原生質體的制備膜片鉗技術簡述膜片鉗技術簡述（1）玻璃微電極使用硬質有

14、芯玻璃毛細管在拉制儀（PC-10,Narishige）上拉制，實驗前用拋光儀（MF-900，Narishige）進行拋光。（2）通過顯微操作系統(tǒng)將電極在加正壓情況下輕微壓在細胞上，再加以負壓使電極尖端與細胞膜形成高阻封接。一般情況下，高阻封接在1-3G之間，刺激電壓從-190mV逐級去極化到+110mV，每級為+20mV，維持時間3秒，頻率為0.2Hz。全細胞封接形成10分鐘后采集數(shù)據(jù)。膜片鉗實驗膜片鉗技術簡述膜片鉗技術簡述EPC-9操作界面膜片鉗技術簡述膜片鉗技術簡述膜片鉗技術簡述膜片鉗技術簡述膜片鉗技術簡述膜片鉗技術簡述膜片鉗技術簡述膜片鉗技術簡述膜片鉗技術簡述膜片鉗結果分析膜片鉗技術簡述膜片鉗技術簡述膜片鉗技術簡述膜電流：指流過細胞膜上所有活動性離子通道的復合電流。濃度梯度：膜兩側離子的濃度差，即化學勢梯度。電位差：即電勢差，跨過膜的電位差。平衡電位：離子跨膜流動所需的電位差。離子的選擇性：是通道的開