顯微鑒別法操作規(guī)程

1、第第 頁共9頁文件編號顯微鑒別法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門總頁數(shù)執(zhí)行日期9編制者審核者批準(zhǔn)者編制日期審核日期批準(zhǔn)日期內(nèi)容：顯微鑒別法：系指用顯微鏡對藥材或飲片的切片、粉末、解離組織或表面制片及含飲片粉末的制劑中飲片的組織、細(xì)胞或內(nèi)含物等特征進(jìn)行鑒別的一種方法。儀器和用具儀器生物光學(xué)顯微鏡、顯微描繪器、滑走切片機、小型粉碎機或徒手圓筒生物切片器、鏡臺測微尺、離心機。用具放大鏡、刀片、解剖刀、鑷子（包括粗鑷及眼科彎鑷與直鑷）、剪（眼科剪與手術(shù)剪）、解剖針。載玻片、蓋玻片吸濕器（即玻璃干燥器改裝蒸餾水加微量苯酚，潮氣潤濕藥材樣品用）、培養(yǎng)皿或小燒杯（放切片用，切片后的處理均可在其中進(jìn)行）、酒精燈、鐵三角架

2、、石棉網(wǎng)、滴瓶、試管、試管架、滴管、玻璃棒（粗與細(xì)）、乳缽、量筒等毛筆（從刀上刷取切片用）、鉛筆（HB、3H、6H繪圖用）、帶蓋搪瓷盤（裝切片標(biāo)本用）、紗布、吸水紙（濾紙）、火柴等。試藥與試液水合氯醛試液取水合氯醛50g,加水15ml與甘油10ml使溶解，即得。此液為透化劑，可使干縮的細(xì)胞壁膨脹而透明，并能溶解淀粉粒、樹脂、蛋白質(zhì)及揮發(fā)油等。甘油醋酸試液（斯氏液）取甘油、冰醋酸與水各等份，混合即得。此液專用于觀察淀粉形態(tài)，可使淀粉不膨脹變形，便于測量其大小。甘油-乙醇溶液取甘油1份，50%乙醇1份，混合即得。此液為封藏液，用于保存植物材料及臨時切片，有軟化組織的作用。蘇丹ni試液取蘇丹nio.

3、oig,加90%乙醇5ml溶解后，加甘油5ml,搖勻即得。本液應(yīng)置棕色玻璃瓶內(nèi)保存，在2個月內(nèi)應(yīng)用。此液可使木栓化、角質(zhì)化細(xì)胞壁及脂肪油、揮發(fā)油、樹脂等染成紅色或淡紅色。釕紅試液取10%醋酸鈉溶液12ml,加釘紅適量使呈酒紅色即得。本液應(yīng)臨用新制。此液可使粘液染成紅色。間苯三酚試液取間苯三酚1g,加90%乙醇100ml使溶解，濾過即得。應(yīng)置棕色玻璃瓶內(nèi)，在暗處保存。此液與濃鹽酸合用,可使木化細(xì)胞壁染成紅色或紫紅色。碘試液取碘化鉀0.5g,溶于少量水中，加碘1g,使溶解，加水至100ml即得。應(yīng)用時能常再加水稀釋成淡棕色或淡黃色。本液應(yīng)置棕色瓶內(nèi)保存。此液用于檢查淀粉,染成藍(lán)色或紫色；蛋白質(zhì)或糊

4、粉粒呈黃色。硝鉻酸試液取硝酸10山1,加入100ml水中，混勻。另取鉻酸10g,加水100ml使溶解。用時將二液等量混合,即得。此液為常用的“植物組織解離液”。檢品的解離浸泡時間,按材料的質(zhì)地不同而異。a-萘酚試液取15%的a-萘酚乙醇溶液10.5ml,緩緩加入硫酸6.5ml,混勻后再另加乙醇40.5ml及水4ml,混勻即得。此液用于檢查菊糖，染成紫紅色，并很快溶解。硝酸汞試液（米隆氏試液）取汞4.5g,加發(fā)煙硝酸3ml,俟作用完畢，加等量水稀釋即得。本液應(yīng)置棕色玻璃塞瓶內(nèi),在暗處保存。此液用于檢查糊粉粒,染成磚紅色。氯化鋅碘試液取碘化鉀8g,加水8.5ml使溶解，再加無水氯化鋅2.5g使溶解

5、，加碘適量至飽和，即得。本液應(yīng)置棕色玻璃塞瓶內(nèi)。此液用于檢查木質(zhì)化與纖維素細(xì)胞壁,前者顯黃棕色,后者顯藍(lán)色或紫色。顯微標(biāo)本的制作切片制作標(biāo)本片（橫切或縱切）藥材的預(yù)處理先將藥材表面泥沙刷洗干凈，將應(yīng)觀察的部位，切成適當(dāng)大小的塊或段，一般以寬1cm、長3cm為宜，切面削平整。質(zhì)地軟硬適中的藥材可直接進(jìn)行切片；質(zhì)地堅硬的則須先使其軟化后再切片。軟化方法可放在吸濕器（即玻璃干燥器底部盛蒸餾水并滴數(shù)滴苯酚防霉，上部瓷板上置藥材樣品吸濕）中悶潤，或在水中浸軟或煮軟。有些根、根莖、莖及木類藥材或飲片，質(zhì)地較堅實，可將削平的切面浸水中片刻，待表面潤濕時取出，直接切片也能切成較完整的薄片。過于柔軟的樣品，可將

6、其浸入70%95%乙醇中，約20分鐘后可變硬些，即可進(jìn)行切片。對于細(xì)小、柔軟而薄的藥材或飲片，如種子或葉片，不便直接手持切片，可用胡蘿卜、土豆、軟木塞或橡皮等作夾持物。將夾持物一側(cè)切一窄縫，將樣品嵌入其中，葉類藥材或飲片可用質(zhì)地松軟的通草或向日葵的莖髓作夾持物。新鮮樣品則直接進(jìn)入石蠟中，使樣品外面包上一層石蠟，再切片。藥材和飲片預(yù)處理時，應(yīng)注意不能影響要觀察的顯微鑒別特征。如要觀察菊糖、粘液等在軟化、切片、裝片等過程中，均不可與水接觸，以免特種溶解消失；觀察揮發(fā)油、樹脂等，則不可與高濃度乙醇或其它有機溶劑接觸。切片徒手切片在檢驗工作中，此法最常用，操作簡便，迅速，制成的切片可保持其細(xì)胞內(nèi)含物的

7、固有形態(tài)，便于進(jìn)行各種顯微化學(xué)反應(yīng)觀察。切片：右手持刀片，左手拇指和食指夾持樣品，中指托著樣品的底部，使樣品略高出食、拇二指，肘關(guān)節(jié)應(yīng)固定，使樣品的切面保持水平，刀口向內(nèi)并使刀刃自前右切削，即可切得薄片。操作時，樣品的切面和刀刃須經(jīng)常加水或稀乙醇保持濕潤，防止切片粘在刀片上。切好的切片用毛筆蘸水輕輕從刀片上推入盛有水或稀乙醇的培養(yǎng)皿中。滑走切片機切片此法不需要較高的技切，只要了解掌握操作方法，短時間內(nèi)即可學(xué)會并切出較薄的切片，適用于質(zhì)地堅實、形狀較大的藥材樣品，柔軟的樣品經(jīng)冷凍處理亦可切得較薄的切片。切片機調(diào)試及材料安裝：切片前，先安置好切片機使穩(wěn)固，進(jìn)行調(diào)試檢查。將切片刀夾持在夾刀器上夾緊，

8、調(diào)整刀的角度（約015）；調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器至所需厚度。把制備好的樣品用兩塊軟木夾住或直接放在切片機的材料固定架上夾緊夾正，使樣品露出軟木塊或固定器上端約0.5cm,調(diào)整好樣品高度，使刀刃靠近樣品的切面，使樣品切面與刀刃平行并略高于刀刃約0.51mm。切片：用右手握夾刀器柄。往操作者方向迅速拉動，便切下切片，且附著于刀的表面上，用毛筆蘸水把切片放于盛水的培養(yǎng)皿中。將刀推回原處，轉(zhuǎn)動厚度推進(jìn)器，用毛筆直蘸水潤濕樣品切面及刀刃，再拉切片刀，往返推拉，可得到許多厚度均勻、完整的切片。若切片不成功，應(yīng)檢查切片刀是否鋒銳，否則應(yīng)磨刀或換鋒銳的切片刀，若切得太薄而破碎，則逐漸增加厚度至能切得完整的薄片為度。注

9、意：夾持在材料固定器上的樣品切面接近于固定器上端時，必須注意防止切片刀刃碰撞固定器而損毀切片刀。裝片選取薄而平整的切片置載玻片上，根據(jù)所要觀察的內(nèi)容要求，滴加適宜的試液12滴，蓋好蓋玻片，即可在顯微鏡下觀察。為防止切片彎卷，可選取理想的切片，用兩張載玻片夾往，放置水中放置4小時左右將切片壓平，取出，置乙醇中固定，再以稀甘油裝片觀察。如需透化，可在載玻片上放有切片處，滴加12滴水合氯醛試液，在酒精燈上微微加熱，至邊緣起小泡即停止加熱，繼續(xù)補充試液再加熱，直至切片透化完全為止；加熱溫度不能過高，以防水合氯醛試液沸騰，使組織內(nèi)帶入氣泡；加熱時應(yīng)將載玻片不斷移動，不宜對準(zhǔn)一處燒，以免受熱不勻而炸裂；透

10、化后放冷，加甘油乙醇試液12滴后蓋上蓋玻片，貼上標(biāo)簽。冬日室溫較低時，透化后可不待放冷即滴加甘油乙醇試液，以防水合氯醛結(jié)晶析出而防礙觀察。粉末制片主要用于粉末狀的藥材和飲片及含飲片粉末的制劑的觀察。粉末制備藥材要先干燥，磨或銼成細(xì)粉（過四號篩），裝瓶，貼上標(biāo)簽。粉末制備時，注意取樣的代表性，例如：根類藥材要切取根頭、根中段及根尾等部位，必須全部磨成粉，不得丟棄渣頭。并需通過4號篩，混合均勻。干燥時，一般溫度不能超過60，以免淀粉粒糊化，難以觀察其完整者。粉末制片法用解剖針挑取粉末少許，置載玻片的中央的位置，加適宜的試液1滴，用針攪勻（如為酸或咸時應(yīng)用細(xì)玻棒代替針），待液體滲入粉末后，用左手食指

11、與拇指夾持蓋玻片的邊緣，使其左側(cè)與藥液層左側(cè)接觸，再用右手持小鑷子或解剖針托住蓋玻片的右側(cè)，輕輕下放，則液體逐漸蔓延充滿蓋玻片下方。如液體未充滿蓋玻片，應(yīng)從空隙相對邊緣滴加液體，以防產(chǎn)生氣泡；若液體過多，用濾紙片吸去溢出的液體，最后在載玻片的左端貼上檢品的標(biāo)簽或?qū)懮蠘?biāo)記。成方制劑粉末制片按劑型不同，分別將樣品處理后，按粉末制片法裝片觀察散劑、膠囊劑，可直接取適量粉末（內(nèi)容物為顆粒狀，應(yīng)研細(xì)）裝片或透化后裝片。片劑，可取23片；水丸、糊丸、水蜜丸、錠劑等（包衣這除去包衣）取數(shù)丸或12錠，分別置乳缽中研細(xì)，取粉末適量裝片或透化裝片。蜜丸樣品可用兩種方法處理。用解剖刀沿蜜丸正中切開，從切面由外至中央

12、挑取適量樣品，置載玻片中央，滴加適宜的試液，用玻璃棒攪勻。按上述粉末制片法制片，或透化裝片。將蜜丸切碎放入容器中，加水適量，攪拌；亦可用超聲儀處理，使其分散，然后置離心管中離心沉淀，如此反復(fù)以除盡蜂蜜，取沉淀物適量裝片或透化后裝片。含揮發(fā)性成分的制劑，取其粉末進(jìn)行微量升華裝片。粉末制片的注意事項藥材和飲片粉末制片時，每片取用量宜少不宜多，為使觀察全面可多做些制片。如取樣多，顯微特征重疊輪廓不清，反而費時，不易得出準(zhǔn)確的結(jié)論。成方制劑粉末檢查，是在多味飲片粉末中尋找某一藥味的某一顯微特征，有時較難查見，可以去粉末適量，置試管或小燒杯中，加水合氯醛試液透化（加適量甘油以防水合氯醛結(jié)晶析出），攪勻，

13、用吸管吸取混懸液裝片，觀察。如粉末樣品如用水或甘油裝片時，可先加少量乙醇使其潤濕，可避免或減少氣泡的形成，或反復(fù)將蓋玻片沿一側(cè)輕抬，亦可使多數(shù)氣泡逸出。攪拌時產(chǎn)生的氣泡可隨時用針將其移出。裝片用的液體如易揮發(fā)，應(yīng)裝片后立即觀察。用水裝片也較易蒸發(fā)而干涸，通常滴加少許甘油可延長保存時間。表面制片主要用于葉類、花類（萼片、花瓣）、果實、草質(zhì)莖及鱗莖等藥材或飲片的表面特征如毛茸、氣孔、表皮細(xì)胞等的觀察。質(zhì)地菲薄的藥材或飲片可以整體裝片；較厚的藥材或飲片則須撕下表皮然后裝片。整體裝片適用于較薄的葉片、萼片和花瓣、剪取欲觀察部位約4mm2的兩小片，一反一正放在載玻片上，加水合氯醛試液，加熱透化至透明為止

14、，再滴加封藏液，蓋好蓋玻片，即得。表面撕離裝片凡較厚的或新鮮樣品不便于整體裝片，多采用表面撕離裝片。將軟化或新鮮樣品固定住，然后用鑷子夾住要剝?nèi)∷弘x的部分，小心的撕離，或用解剖刀輕輕割（刮）去不需要的各層組織，只保留表皮層（上層或下層），將欲觀察的表破表面觀朝上，置載玻片上，加水合氯醛試液加熱透化后，再滴加封藏液，蓋上玻片，即得。解離組織片適用于厚壁組織或輸導(dǎo)組織等的單個細(xì)胞的顯微觀察。將樣品切成段（長約5mm，直徑約2mm）或片（厚約1mm），觀察纖維或?qū)Ч艿茸詈们谐煽v長的小段。根據(jù)細(xì)胞壁的性質(zhì)，按照下列方法之一進(jìn)行處理：如對于薄壁組織占大部分，木化組織少或分散存在的樣品，采用氫氧化鉀法；若

15、樣品堅硬，木化組織較多或集成較大群束，采用硝鉻酸法或氯酸鉀法。4.4.1氫氧化鉀法置樣品于試管中，加5%氫氧化鉀溶液適量，加熱至用玻璃棒擠壓，能離散為止，傾去堿液，加水洗滌后，取出少量置載玻片上，用解剖針?biāo)洪_，滴加稀甘油蓋上蓋玻片。硝鉻酸法置樣品于試管中，加硝鉻酸試液適量，使之浸沒樣品，放置約3060分鐘，堅硬的樣品需時要長些，也可在水浴上微溫，至用玻璃棒擠壓能離散為止，傾去酸液，用水洗滌后，照氫氧化鉀法裝片。氯酸鉀法置樣品于試管中，加硝酸溶液（12ml）及氯酸鉀少量，緩緩加熱，待產(chǎn)生的氣泡漸少時，再及時加入氯酸鉀少量以維持氣泡穩(wěn)定地發(fā)生，至用玻璃棒擠壓能離散為止。傾去酸液，用水洗滌后，照氫氧

16、化鉀法裝片。注意事項用氯酸鉀法制片時，每次加入的氯酸鉀不可過多，加熱溫度不宜過高，否則突沸容易使液體逸出管外。加熱時間長短因樣品的硬度和木化程度而異，通常約需515分鐘。操作過程中產(chǎn)生的氯氣有毒，應(yīng)注意通風(fēng)。用硝鉻酸法解離也可在載玻片上進(jìn)行。即取一塊厚度適當(dāng)?shù)那衅?，置載玻片上，滴加硝鉻酸試液使之浸沒，放置約20分鐘后，輕輕壓下或移動蓋玻片使之分離其余操作同時，法解離的細(xì)胞，可以看清其分離的組織部位?；ǚ哿Ｅc孢子制片取花粉、花藥（或小的花）或孢子囊群（干燥樣品浸于冰醋酸中軟化），用玻璃棒搗碎，紗布過濾，濾液置離心管中，離心，取沉淀加新鮮配制的醋酐與硫酸（9：1）的混合液13ml,置水浴上加熱23

17、分鐘，離心，取沉淀，用水洗滌2次，取沉淀物少量，置載玻片上，直接用水合氯醛試液裝片，具體操作同粉末標(biāo)本片?；蚣?0%的甘油與1%苯酚各12滴，用品紅甘油膠封藏觀察。磨片法制片凡需觀察斷面，以一般切片無法制作的標(biāo)本，如堅硬的動物、礦物為藥材你或飲片，如珍珠、石決明、動物骨骼、礦石等可采用磨片法制片。片的厚度一般為2050口m。磨片方法有手工磨制與機器磨制。手工磨制選取合適的材料，一般以12mm為度，先置粗磨石（或磨砂玻璃板）上，加適量水，用食指、中指夾材料，在磨石上往返磨礪，待兩面磨平，厚度約數(shù)百口m時，移至細(xì)磨石上，加水，用軟木塞壓在上面，往返磨礪至透明，用水沖洗，再用乙醇處理和甘油乙醇試液裝

18、片。機器磨制地質(zhì)礦產(chǎn)部門有專門人員與設(shè)備制作。顯微測量顯微鑒定時應(yīng)用于測量細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)含物等大小的方法，應(yīng)用最多的則是長度測定。常用的量具是目鏡測微尺與載物臺測微尺。目鏡測微尺又稱目鏡量尺或目微尺。它是放在目鏡筒內(nèi)的一種標(biāo)尺，是一個直徑1820mm的圓形玻璃片，中央刻有精確等距離的平行線刻度，常為50或者100格。目鏡測微尺是用以直接測量物體的，但其刻度所代表的長度是根據(jù)顯微鏡放大倍數(shù)不同而改變，故使用前必須用載物臺測微尺來標(biāo)定。載物臺測微尺又稱鏡臺測微尺或臺微尺。它是一種特制的載玻片，中央粘有一刻有精細(xì)尺度的圓形玻片，通常將長1mm（或2mm）精確等分為100（或200）小格的細(xì)線，每一小格

19、長為10口m,它是用以標(biāo)定目鏡測微尺的。目鏡測微尺的標(biāo)定，以確定使用同一顯微鏡及特定倍數(shù)的物鏡、目鏡和鏡筒長度時，目鏡測微尺上每一格所代表的實際長度。標(biāo)定方法：將載物臺測微尺置于顯微鏡鏡臺上，按常規(guī)對光調(diào)焦，并移動測微尺物象于視野中央；從鏡筒中取下目鏡，旋下接目鏡的目鏡蓋，將目鏡測微尺放入目鏡筒中部的光欄上（應(yīng)正面向上），旋上目鏡蓋后返置鏡筒上。此時在視野中，除載物臺測微尺的物象外，還同時可觀察到目鏡測微尺的分度小格，移動載物臺測微尺和旋轉(zhuǎn)目鏡，使兩種量尺的刻度平行。左邊的“0”刻度重合，尋找第二條重合刻度。記錄兩刻度的讀數(shù)，并根據(jù)比值計算出目鏡測微尺每小格在該物鏡條件下所相當(dāng)?shù)拈L度（口m）。測定細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)含物的方法將預(yù)測目的物的顯微制片置載物臺上，對光，調(diào)焦，移動載片，使需測量的目的物置于目鏡量尺范圍內(nèi)，調(diào)清物象，計數(shù)出目的物占測微尺的小格數(shù)，乘以目鏡尺每1小格的長度值即得。計算公式：待測物體長度（口m）=鏡臺微尺與目鏡微尺重合時所具的長度義所測物體占有目鏡測微尺的格數(shù)目鏡測微尺