耐藥結核病診斷新技術-課件

1、耐藥結核病診斷新技術耐藥結核病診斷新技術全球范圍內結核病疫情嚴重 患病率高: 新發(fā)患者1040萬/年,其中有120萬(11%)HIV患者; 死亡率高:每年死亡人數(shù)達140萬(13、46%),HIV/TB:死亡人數(shù)40萬(33、33%); 耐藥率高: 48萬新發(fā)的MDR-TB病例和10萬耐利福平結核病(RR-TB)病例; 接受MDR檢測、報告和治療的MDR-TB不足1/3,接受治療的MDR-TB治愈成功率只有50% 全球結核病報告全球范圍內結核病疫情嚴重全球結核病報告耐藥結核病診斷新技術-課件2015年全球估計MDR-TB患者數(shù)2015年全球估計MDR-TB患者數(shù)結核病快速及時診斷是結核病防控重

2、要因素結核病快速及時診斷是結核病防控重要因素靈敏準確操作簡便檢測時間短閉管檢測檢測位點全面對新型耐藥檢測技術的要求靈敏準確操作簡便檢測時間短閉管檢測檢測位點全面對新型耐藥檢測耐藥結核病診斷新技術-課件基因芯片技術基因芯片技術結核病耐藥與基因64-68% rps L 基因突變70% emb B基因突變70%65%耐藥基因93%95%95% rpo B基因突變利福平異煙肼50-70% kat G基因突變5-10% inh A基因突變6-13% ahp C基因啟動子區(qū)域突變鏈霉素乙胺丁醇 多數(shù)研究報告提示:耐藥的發(fā)生與結核桿菌的基因突變有關?？傮w上是基因一個或幾個核苷酸突變(表現(xiàn)增加、缺失、替代),

3、造成核苷酸編碼錯誤致氨基酸錯位排列,影響藥物與靶位酶結合產生耐藥結核病耐藥與基因64-68% rps L 基因突變70% e基因芯片(原理)激光共焦掃描儀軟件判讀樣品制備儀雜交儀 基因芯片方法是基于結核桿菌的利福平和異煙肼耐藥性相關的rpoB/katG/inhA的基因位點發(fā)生突變,通過PCR擴增、和固定于尼龍膜上的寡核苷酸探針進行雜交、掃描,檢測熒光信號的有無,判斷特定位點的突變情況和結核菌耐藥性。 基因芯片儀和試劑獲國家SFDA和歐盟CE認證10基因芯片(原理)激光共焦掃描儀軟件判讀樣品制備儀雜交儀 基因芯片法基因芯片法耐藥結核病診斷新技術-課件利福平的耐藥位點利福平的耐藥位點MSM恥垢分枝

4、桿菌 MTC結核分枝桿菌復合群MTR次要分枝桿菌MIN胞內分枝桿菌MAV鳥分枝桿菌MGA胃分枝桿菌MKA堪薩斯分枝桿菌MSC瘰癘分枝桿菌MUA母牛分枝桿菌MCH龜分枝桿菌龜亞種MAB龜分枝桿菌膿腫亞種MSZ蘇爾加分枝桿菌MMA海/潰瘍分枝桿菌MXE蟾蜍分枝桿菌MDI迪氏分枝桿菌MFO偶發(fā)/豬分枝桿菌MGI淺黃分枝桿菌MSI猿猴分枝桿菌MTE土分枝桿菌MPH草分枝桿菌CC質控點MNO不產色分枝桿菌MGO戈登分枝桿菌同時鑒定MTC與21種NTMMSM恥垢分枝桿菌 MTC結核分枝桿菌復合群MTR次要分枝桿非結核分枝桿菌非結核分枝桿菌在國內4個省的4個地市級CDC進行了評估。在國內4個省的4個地市級C

5、DC進行了評估。結核病和非結核的診斷結核病和非結核的診斷特 點標本:菌株、涂陽痰標本 時間:約8小時優(yōu)點:高通量靈敏度、特異度高特 點標本:菌株、涂陽痰標本 國家結核病參比實驗室推薦建議基因芯片能夠用于: 可疑耐藥結核病患者篩查,它有望代替利福平和異煙肼的傳統(tǒng)藥敏試驗推薦理由:在我國獲得注冊證書;國內研究顯示其敏感性和特異性較好;民族品牌數(shù)據(jù)顯示在我國具有可行性,符合成本效果;估計使用層級: 地市和省級(醫(yī)療機構和疾病預防機構)國家結核病參比實驗室推薦建議基因芯片能夠用于: 推薦理由:估探針熔解曲線技術探針熔解曲線技術工作原理 在一定環(huán)境下,DNA雙鏈在其長度和序列一定時,Tm值也一定,當發(fā)生

6、錯配時,Tm值下降,下降的幅度與發(fā)生錯配的堿基數(shù)目、類型和位置有關。Tm工作原理 在一定環(huán)境下,DNA雙鏈在其長度和序列一定時,T96%利福平耐藥突變發(fā)生在rpoB507-533共81bp區(qū)域內利福平耐藥突變檢測體系示意圖依照靶序列熔點的變化,檢測rpoB基因 是否含有突變,獲得利福平耐藥信息96%利福平耐藥突變發(fā)生在rpoB507-533共81bp區(qū)依照不同的Tm值能夠判斷出ropB估計不同的堿基發(fā)生突變依照不同的Tm值能夠判斷出ropB估計不同的堿基發(fā)生突變耐藥結核病診斷新技術-課件依照不同的Tm值能夠判斷出ropB估計不同的堿基發(fā)生突變依照不同的Tm值能夠判斷出ropB估計不同的堿基發(fā)生

7、突變異煙肼耐藥突變檢測體系示意圖通過檢測 katG315、inhA 啟動子和、ahpC 啟動子區(qū)、inhA94 、密碼子的突變與否確定樣品對異煙肼的耐藥性。異煙肼耐藥突變檢測體系示意圖通過檢測 katG315、inh依照不同的Tm值能夠判斷出異煙肼不同的堿基序列發(fā)生突變依照不同的Tm值能夠判斷出異煙肼不同的堿基序列發(fā)生突變依照不同的Tm值能夠判斷出異煙肼不同的堿基序列發(fā)生突變依照不同的Tm值能夠判斷出異煙肼不同的堿基序列發(fā)生突變乙胺丁醇鏈霉素氟喹諾酮每個突變都表現(xiàn)出特有的譜線 對應獨特的熔點, 軟件能夠自動地給出突變類型,即使發(fā)生不均一突變的情況,也能夠分辨出來、乙胺丁醇鏈霉素氟喹諾酮每個突變

8、都表現(xiàn)出特有的譜線 對應獨特的步驟二加入1-96個提取樣本到檢測管中步驟三集成多重PCR和結果自動報告步驟一自動提取1-24份樣本操作流程總耗時約3小時,手工操作時間約15分鐘步驟二步驟三步驟一操作流程總耗時約3小時,手工操作時間約15(一)DNA提取40 min高質量的樣本DNA 樣本類型:痰液、灌洗液、培養(yǎng)菌株快速高效,1小時內完成24份樣本提取;靈活可控,單次運行可處理124 份樣本;高度均一,整個提取過程均由儀器自動完成,保證了提取樣本的均一性。(一)DNA提取40 min高質量的樣本DNA (二)加入PCR反應管(二)加入PCR反應管(三)PCR過程和自動判讀菌種Tm / FAMHE

9、XROXCy5恥垢分枝桿菌83、0/73、0,80、0/牛分枝桿菌62、5,75、5/73、0,80、0/瘰疬分枝桿菌69、5/73、0,80、0/結核分枝桿菌62、5/73、0,80、0/龜分枝桿菌55、5/73、0,80、0/猿猴分枝桿菌/81、073、0,80、0/嗜血分枝桿菌/76、073、0,80、0/戈登分枝桿菌/71、073、0,80、0/堪薩斯分枝桿菌/66、573、0,80、0/膿腫分枝桿菌/58、073、0,80、0/偶然分枝桿菌/65、5,73、0,80、0/海/潰瘍分枝桿菌/59、5,73、0,80、0/土地分枝桿菌/55、5,73、0,80、0/不產色分枝桿菌/50、5,73、0,80、0/蘇加分枝桿菌/73、0,80、082、