免疫組化熒光組化培訓(xùn)課件

1、免疫組化熒光組化免疫組化熒光組化一、熒光的特征熒光 躍遷到激發(fā)態(tài)的電子，大多處于單重激發(fā)態(tài)。如果電子直接從單重激發(fā)態(tài)以輻射方式躍遷到基態(tài)，由于單重激發(fā)態(tài)很不穩(wěn)定，半衰期很短，發(fā)射持續(xù)的時間也很短，這種發(fā)射光，叫熒光。免疫組化熒光組化2一、熒光的特征熒光 躍遷到激發(fā)態(tài)的電子，大多處于單重激二、熒光素 能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為熒光色素，必須具備：吸收激發(fā)光的光能并發(fā)射熒光。免疫組化熒光組化3二、熒光素 能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物 1、具備用于標(biāo)記抗體的熒光素條件(1)應(yīng)具有與蛋白質(zhì)分子形成共價鍵的化學(xué)基團，結(jié)合后不易離解，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易排除。免疫組化熒光組化4 1、

2、具備用于標(biāo)記抗體的熒光素條件(1)應(yīng)具有與蛋白質(zhì)分子(2)熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后熒光 素質(zhì)量下降不多。(3)標(biāo)記后對抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化 性質(zhì)無影響。(4)結(jié)合方法簡便而快速，并且較穩(wěn)定。免疫組化熒光組化5(2)熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后熒光 素質(zhì)量下降不多。(5)熒光素容易溶解，溶解后不會和其 他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。(6)熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏 色對比鮮明，能清晰判斷結(jié)果。免疫組化熒光組化6(5)熒光素容易溶解，溶解后不會和其 免疫組化熒光組化62.熒光素的種類(1)異硫氰酸熒光黃（FITC）：分子量390D，最大吸收光譜為490495nm，最大發(fā)射光譜為520530nm。呈現(xiàn)明

3、亮的黃綠色熒光，分子量389.4。免疫組化熒光組化72.熒光素的種類(1)異硫氰酸熒光黃（FITC）：分子量3免疫組化熒光組化8免疫組化熒光組化8(2)四甲基異硫氰酸羅達明（TRITC）是羅達明的衍生物，易溶于水，最大吸收光譜為550nm，最大發(fā)射光譜為620nm，呈橙紅色熒光。免疫組化熒光組化9(2)四甲基異硫氰酸羅達明（TRITC）是羅達明的衍生物，易免疫組化熒光組化10免疫組化熒光組化10(3)四乙基羅達明(RB200) 呈褐紅色粉末狀，溶于乙醇和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光譜570nm，最大發(fā)射光譜596600nm，呈明亮橙紅色熒光，分子量580，RB200不能直接和蛋白質(zhì)結(jié)

4、合，要先經(jīng)五氯化磷反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成硫酰氯，再與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合。免疫組化熒光組化11(3)四乙基羅達明(RB200) 呈褐紅色粉末狀，溶于乙醇和免疫組化熒光組化12免疫組化熒光組化12(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯(5)4-乙酰胺-4-異硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）(6)得克薩斯紅（Texas red）(7)藻紅蛋白（PE）(8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）免疫組化熒光組化13(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯(5)4-乙酰胺-4-異硫三、熒光抗體的質(zhì)量控制主要進行特異性和敏感性兩個方面的鑒定。1.特異性染色效價測定2.非特異性染色測定3.吸收試驗4.F/P比值的測定方法免疫組

5、化熒光組化14三、熒光抗體的質(zhì)量控制主要進行特異性和敏感性兩個方面的鑒定四、免疫熒光組織化學(xué)染色方法 1.直接法 簡便、快速，用已知特異性標(biāo)記熒光的一抗與組織細胞內(nèi)抗原結(jié)合。免疫組化熒光組化15四、免疫熒光組織化學(xué)染色方法 1.直接法 簡便、快速(2)適當(dāng)稀釋熒光抗體滴加在組織切片上，濕盒內(nèi)37溫育1h，PBS洗33min。(3)0.01%伊文氏藍襯染13min，PBS洗33min，蒸餾水洗2次，除去Nacl結(jié)晶。(4)pH9.0緩沖甘油封片。(5)鏡檢免疫組化熒光組化16(2)適當(dāng)稀釋熒光抗體滴加在組織切片上，濕盒內(nèi)37溫育1h免疫組化熒光組化17免疫組化熒光組化172.間接法 是直接法的重

6、要改進，先用標(biāo)記的已知特異性一抗與組織細胞內(nèi)抗原結(jié)合，隨后用間接熒光標(biāo)記二抗與一抗特異性結(jié)合。免疫組化熒光組化182.間接法 是直接法的重要改進，先用標(biāo)記的已知特異性一抗與免疫組化熒光組化19免疫組化熒光組化19五、熒光顯微鏡檢查方法 1.熒光顯微鏡 熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的基本工具。它是由超高壓光源，濾片系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)，光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成，是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。免疫組化熒光組化20五、熒光顯微鏡檢查方法 1.熒光顯微鏡 熒光顯微鏡(1)光源 光源的亮度應(yīng)根據(jù)熒光素的類型選擇。小功率汞燈可滿足激發(fā)一般熒光染料的要求。對于免疫熒光染色需用大功率超高壓

7、汞燈。其工作時，兩個電極間放電，引起球內(nèi)水銀蒸發(fā)，經(jīng)過515min，球內(nèi)氣壓升至5070標(biāo)準大氣壓，此時達到最高亮度，成為穩(wěn)定工作狀態(tài)。免疫組化熒光組化21(1)光源 光源的亮度應(yīng)根據(jù)熒光素的類型選擇。小功率汞燈可免疫組化熒光組化培訓(xùn)課件濾片系統(tǒng)包括激發(fā)濾片，阻斷濾片、隔熱濾片，分光鏡和其他一些中性濾片。免疫組化熒光組化23濾片系統(tǒng)包括激發(fā)濾片，阻斷濾片、隔熱濾片，分光鏡和其他一些中免疫組化熒光組化24免疫組化熒光組化242.標(biāo)本制作要求(1)載玻片厚度應(yīng)在0.61.2mm之間(2)蓋玻片應(yīng)光潔，厚度在0.17mm左右(3)標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部

8、不能充分激分。免疫組化熒光組化252.標(biāo)本制作要求(1)載玻片厚度應(yīng)在0.61.2mm之間(4)封片劑 常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.59.5時較亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.09.5的碳酸鹽緩沖液等量混合作封片劑。免疫組化熒光組化26(4)封片劑 常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮熒光信號增強封片劑 聚乙烯醇40-88 4.8g 甘油 12ml 蒸餾水 12ml 0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml免疫組化熒光組化27熒光信號增強封片劑 聚乙烯醇40-88 上述混合（加熱溶解），5000g離心，15min，最后加入1.4-

9、diazobicydo-2,2,2-octane(DABcos)，終濃度2.5%(約1.25g)，溶解后，分裝存于-20中。免疫組化熒光組化28 上述混合（加熱溶解），5000g離心，15min，最3.使用熒光顯微鏡注意事項(1)嚴格按說明書操作，不要隨意改變程序。(2)應(yīng)在暗室中進行檢查。(3)防止紫外線對眼睛的損害。在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡。(4)檢查時間每次以12h為宜，超過90min，超高壓汞燈強度逐漸下降，熒光減弱。免疫組化熒光組化293.使用熒光顯微鏡注意事項(1)嚴格按說明書操作，不要隨意(5)熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。光源關(guān)閉后必須在30min后才能再啟動光源，一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源。免疫組化熒光組化30(5)熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保(6)標(biāo)本染色后應(yīng)立即觀察。(7)熒光高度的判斷標(biāo)準，分四級“ ”為陰性，“ ”為僅能見明確可見的熒光；“ ”為可見有明亮的熒光；“ ”為可見耀眼的熒光。免疫組化熒光組化31(6)標(biāo)本染色后應(yīng)立即觀察。(7)熒光高度的判斷標(biāo)準，分四免疫組化熒光組化32免疫組化熒光組化32免疫組化熒光組化33免疫組化熒光組化33免疫組化熒光組化34免疫組化熒光