免疫膠體金的技術(shù)

1、關(guān)于免疫膠體金技術(shù)第1頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四膠體金標(biāo)記技術(shù)的相關(guān)定義免疫膠體金技術(shù) 是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗 體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金標(biāo)記 實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。第2頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四膠體金技術(shù)的發(fā)展Development of Immune colloidal gold technique 1939-雛形 Kausche等把煙草花葉病毒吸附到金顆粒上在電子顯微鏡下觀察金離子呈高電子密度。1971-作為標(biāo)記物應(yīng)用于免疫組織化學(xué)研究 Faulk等首先將兔抗沙門菌抗血清與

2、膠體金顆粒結(jié)合，用直接免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)沙門菌的表面抗原。1974-實(shí)現(xiàn)間接免疫金染色法 Romano將膠體金標(biāo)記到馬抗人的IgG上，實(shí)現(xiàn)了間接免疫金染色法第3頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四膠體金技術(shù)的種類及優(yōu)點(diǎn)快速免疫金滲濾法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flow through)的固相膜免疫測(cè)定。 主要由兩部分組成：膜滲濾裝置和標(biāo)記結(jié)合物。前者為一塑料小盒，其中填滿吸水性物質(zhì)，面上緊貼放置一片吸附有抗體(以雙抗體夾心法測(cè)抗原為例)的硝酸纖維膜，標(biāo)記結(jié)合物為免疫金。A：金標(biāo)記抗體B：標(biāo)本中的抗原C：包被抗體D：NC

3、膜E：吸水材料F：塑料盒第4頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四 免疫層析法( immunochromatogra-phy，ICA) 是繼IGFA之后發(fā)展起來(lái)的另一種固相膜免疫測(cè)定，與IGFA利用微局限性膜的過(guò)濾性能不同，免疫層析法中滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細(xì)管作用(基于層析作用的橫流 （lateral flow） )向另一端移動(dòng)。移動(dòng)過(guò)程中被分析物 與固定在膜上某一區(qū)域的受體(抗原或者抗體)結(jié)合而被固相化，無(wú)關(guān)物質(zhì)則越過(guò)該區(qū)域而被分離，然后通過(guò)標(biāo)記物顯色來(lái)判定試驗(yàn)結(jié)果，以膠體金為標(biāo)記物的實(shí)驗(yàn)稱為膠體金免疫層析試驗(yàn)。第5頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分

4、，星期四免疫膠體金技術(shù)的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)方法簡(jiǎn)單而快速，數(shù)分鐘即可得出結(jié)果；不需儀器設(shè)備，操作人員不需特殊訓(xùn)練；試劑穩(wěn)定，適用于單份測(cè)定；無(wú)污染。GICA的特點(diǎn)是單一試劑，一步操作。小型實(shí)驗(yàn)室即有條件開(kāi)發(fā)生產(chǎn)。干燥包裝的試劑可在室溫保存一年以上。 成為目前“病人身邊檢驗(yàn)”（point-of-care testing，POCT）中廣為應(yīng)用的方法。第6頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四 最近由于原料的精選和制作工藝的改進(jìn)，已能制備出可用于定量測(cè)定的GICA試劑。Roche公司生產(chǎn)的用于急性心肌梗死診斷的肌鈣蛋白和肌紅蛋白的GICA試劑和匹配的簡(jiǎn)便測(cè)讀器Cardiac Reade

5、r，其精密度和準(zhǔn)確性均符合定量測(cè)定要求。 不足： 金免疫測(cè)定中應(yīng)用的是單份試劑，難于進(jìn)行質(zhì)量控制。即使是同一批生產(chǎn)的試劑，也很難保證每個(gè)試劑的同一性。因此金免疫測(cè)定一般只能用于定性試驗(yàn)。其定量檢測(cè)和靈敏度的提高還有賴于新原料和新材料的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。第7頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四Colloidal Gold SynthesisSolution color varies extensively with particle sizeUsually a deep red, but also dark brown/purple to light orange/yellowCo

6、lloid size can be controlled by Au:Citrate ratiosAnywhere between 1nm - 100nm +Citrate is easily substituted by other more Au-philic molecules (i.e thiols)H2O, 100OCH2AuCl4Cit-Cit-Cit-Cit-Turkevich, et. al. Discussions Faraday Soc. 1951, No. 11 55-75.第8頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四第9頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20

7、日，9點(diǎn)51分，星期四Procedure of Colloidal Gold SynthesisAdd 100 mL of 1.0 % HAuCl4 to a 200 mL Erlenmeyer flask on a stirring hot plate. Add a magnetic stir bar and bring the solution to a boil To the boiling solution, add 1.5 mL of a 1% solution of trisodium citrate dihydrate, Na3C6H5O7.2H2O Stop heating w

8、hen a deep red color is obtained. 第10頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四Synthesis and properties of different particle size 膠體金粒徑(nm) 1%檸檬酸三鈉加入量(ml)膠體金特性 呈色 max162橙色518nm24.51.5橙色522nm411紅色525nm71.50.7紫紅535nm第11頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四TEM Images of Colloidal AuAverage particle size 17nmGood gold colloi

9、ds and bad (unstable) gold colloids . 劣質(zhì)金外形不均一，且非球形，有凝集現(xiàn)象，顆粒間變異系數(shù)較大 第12頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四How are the antibodies coupled to the gold? Conjugation of antibodies to gold particles depends upon three separate but dependent phenomena :a). ionic attraction between the negatively charged gold and

10、 the positively charged protein b). hydrophobic attraction between the antibody and the gold surface c). Sulfur binding (Cysteine and Methionine)Strongest binding suggested to be the sulfur hinge joining the the two Fc regions第13頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四膠體金顆粒帶電情況 抗體和金顆粒的耦聯(lián)（圖出處：IVD Technology） 第14

11、頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四SAMPLE GOLD CONJUGATION PROTOCOLAdjust the gold colloid to the proper pH; Determined the minimum amount of protein ;Final conjugation Purification 第15頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四Adjust the gold colloid to the proper pH 膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(PI)略偏堿的條件下二者才能牢固地結(jié)合

12、，因此，標(biāo)記之前須將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏堿。 需要提高膠體金的pH值時(shí)可用0.1molK2CO3，需要降低膠體金的pH值時(shí)可用0.1N HCl。測(cè)定金溶液的pH可能損害pH測(cè)定計(jì)的探頭，因此，一般用精密的pH試紙測(cè)定其pH即可.第16頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四蛋白 與膠體金結(jié)合的最佳pH測(cè)定取若干1.5ml的試管，分別加入1ml膠體金用K2CO3將pH分別調(diào)為3，4，5，6，7，8，9，10；去96孔培養(yǎng)板，按pH從高到低分別將上述膠體金分別取100ul加入孔中，重復(fù)三次；每孔分別加入20ul濃度為10%的NaCl溶液，混合，室溫下放置1

13、0min；觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低pH第17頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四Adjust the gold colloid to the proper pH常用幾種蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)膠體金所用的pH值第18頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四Determined the minimum amount of protein（1）光電比色法：制備一系列不同濃度的等體積蛋白質(zhì)溶液（1ml），分別加入5ml膠體金中，迅速混勻，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，搖勻，靜置5min后測(cè)各管。根據(jù)膠體金顆粒的大小，OD在520580nm之間測(cè)定，以

14、OD值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)用量為橫坐標(biāo)作一曲線，取曲線最先與橫軸相接近的那一點(diǎn)處的蛋白質(zhì)用量為最適穩(wěn)定量。圖5.2中10nm的膠體金溶液中蛋白質(zhì)的最適穩(wěn)定量為45g/ml。第19頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四（2）目測(cè)法：以目測(cè)法確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例，將標(biāo)記的蛋白質(zhì)逐級(jí)稀釋后（由5g45g另設(shè)對(duì)照管），各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內(nèi)分別加入0.1ml 10%氯化鈉，依表5-5順序進(jìn)行。第20頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四1. Pipette 1ml of colloid into each

15、of a series of 3ml clean plastic tubes. 2. Adjust the antibody (0.1ug/ul) to the proper pH with 100nM K2CO3 or 100mM HC1. 3. Add the antibody to each tube in a series from 0-150ul (ie 0-15ug in steps of 0, 1, 2, 3 .15ug). 4. Shake each tube and leave for approximately 5 minutes to conjugate. 6. To e

16、ach tube add 100ul of 10% NaC1 and agitate for 1 minute. 7. The Tube containing the minimum amount of protein required to stabilize the gold sol is indicated by the one in which the color of the gold sol does not change from red to blue upon the addition of NaCl. 第21頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四Final

17、 conjugation (IgG)Take 100ml of gold sol and adjust to Ph9Adjust the dialyzed and centrifuged antibody solution (0.1ug/ul) to pH9.2 Add the determined amount of antibody solution dropwise to the gold while stirring rapidlyAfter 5 minutes add 10ml of filtered 10% BSA at pH9 and stir gently for 10 min

18、utes. 第22頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四Purification The gold conjugate must be purified from excess antibody and any small clusters removed before concentrating and storing. Spin the gold conjugate at speeds according to gold particle size .The gold conjugate will form a loose precipitate at the botto

19、m of the tube. Discard the clear supernatant and resuspend the pellet with proper buffer.The gold conjugate, if correctly made, will be stable at 4 for several months.If long term storage is required is should be aliquoted into 1ml volumes and 20% glycerol added. It may then be frozen and kept at -2

20、0 for years. 第23頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四膠體金免疫層析法試劑的組成第24頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四樣品墊(Sample pad)： 玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無(wú)紡布等多種材質(zhì)，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。 樣品墊的作用： 減緩樣品滲透速度，有利于樣品在結(jié)合墊上均勻分布； 去除樣品中雜質(zhì)顆粒； 調(diào)節(jié)樣品液pH值或粘度等。樣本墊可使用化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行浸漬處理，從而減少樣本差異，提高試驗(yàn)的靈敏度。通?？梢詫⑾礈靹⒄承栽鰪?qiáng)劑、阻滯劑及鹽滲入樣本墊然后加以干燥，該工藝可避免使用復(fù)雜辨識(shí)劑/追跡緩沖液的麻煩，使檢測(cè)一步完成。第25頁(yè)，

21、共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四結(jié)合墊(Conjugate pad)： 玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無(wú)紡布等多種材質(zhì)，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。結(jié)合墊的作用主要為： -吸附一定量的金標(biāo)結(jié)合物顆粒；-吸附并持續(xù)不斷的將樣品轉(zhuǎn)移到NC膜上；-保持金標(biāo)結(jié)合物顆粒的穩(wěn)定性；-保證金標(biāo)結(jié)合物顆粒定量完全釋放等。 第26頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四硝酸纖維素膜( Nitrocellulose)： 推薦使用Millipore，MDI，S&S，whatman 等國(guó)外公司的硝酸纖維素膜。 NC膜的作用： - 在檢測(cè)線和對(duì)照線條帶區(qū)域固定抗體；-樣品在NC膜上流動(dòng)并與試

22、劑混合發(fā)生免疫反應(yīng)；-反應(yīng)在NC膜上顯色，讀檢測(cè)結(jié)果 NC膜的重要參數(shù)： 孔徑、對(duì)稱性、層析速度、表面活性劑、蛋白結(jié)合力、強(qiáng)度、表面質(zhì)量、厚度、批間均一性等。第27頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四硝酸纖維素膜與蛋白結(jié)合的原理 主要有兩種假說(shuō)： 1）首先兩者靠靜電作用力結(jié)合，然后靠H鍵和疏水作用來(lái)維持長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合。 2）首先兩者靠疏水作用結(jié)合，然后靠靜電作用來(lái)維持長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合。兩條假說(shuō)，都表明其結(jié)合過(guò)程分為兩步，首先結(jié)合和后面長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合。由于結(jié)合原理的不明確性，導(dǎo)致在這方面的工作非常依賴實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。第28頁(yè)，共33頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)51分，星期四硝酸纖維膜的選擇膜的分類標(biāo)準(zhǔn)(m和s) m: 指的是膜孔徑， s: 以秒為單位的定義為，每4cm膜，水的層析時(shí)間是*s. 換算情況大致為：8um