乙肝病毒cccDNA檢測課件

1、 乙型肝炎病毒cccDNA 檢測方法與應(yīng)用價(jià)值乙肝病毒cccDNA檢測1 乙型肝炎病毒cccDNA 一、幾個相關(guān)問題簡介乙肝病毒cccDNA檢測2一、幾個相關(guān)問題簡介乙肝病毒cccDNA檢測2什么是HBV cccDNA? 即共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA)。乙肝病毒感染宿主細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并建立感染狀態(tài)，病毒松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）進(jìn)入細(xì)胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓?fù)涿傅取靶迯?fù)”形成的、結(jié)構(gòu)完整的、超螺旋雙鏈DNA分子。乙肝病毒cccDNA檢測3什么是HBV cccDNA? 即共價(jià)閉合環(huán)狀DNA乙型肝炎病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖乙肝病毒ccc

2、DNA檢測4乙型肝炎病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖乙肝病毒cccDNA檢測4乙型肝炎病毒的復(fù)制過程乙肝病毒cccDNA檢測5乙型肝炎病毒的復(fù)制過程乙肝病毒cccDNA檢測5我們?yōu)槭裁匆P(guān)注HBV cccDNA? cccDNA存在于細(xì)胞核內(nèi)，成為乙肝病毒的復(fù)制“池” 目前尚沒有可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并能夠清除cccDNA 的藥物，這也是現(xiàn)有抗病毒藥物治療效果不佳和治 療后容易復(fù)發(fā)的原因之一 肝臟以外器官組織細(xì)胞可能存在cccDNA，成為肝臟 移植術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)的來源 還沒有穩(wěn)定、可靠、敏感的cccDNA檢測試劑盒問世乙肝病毒cccDNA檢測6我們?yōu)槭裁匆P(guān)注HBV cccDNA? cccDNA存在于為什么沒有c

3、ccDNA檢測試劑盒問世?研究和開發(fā)該檢測技術(shù)的時間不長檢測技術(shù)上的難度較大前期研究主要集中于細(xì)胞模型和動物肝臟 模，不能滿足臨床檢驗(yàn)的需求現(xiàn)有技術(shù)靈敏度不高，檢測低限104 copy /ml左右分研究機(jī)構(gòu)和學(xué)者對檢測技術(shù)的特異性認(rèn) 識不足，存在缺陷乙肝病毒cccDNA檢測7為什么沒有cccDNA檢測試劑盒問世?研究和開發(fā)該檢測技術(shù)多種同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、 rcDNA、ssDNA、整合的HBV DNA），必須有 效地分離cccDNA和其他類型的病毒DNA如何進(jìn)一步解決特異性的問題？如何解決靈敏度不高的問題（細(xì)胞內(nèi)cccDNA 含量的較低），血清中含量？如何簡化檢測步驟？

4、建立cccDNA檢測技術(shù)必須克服的難點(diǎn)乙肝病毒cccDNA檢測8多種同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、建立ccccccDNArcDNA核酸一級結(jié)構(gòu)完整的雙鏈兩條鏈均不完整核酸空間結(jié)構(gòu)閉合環(huán)狀，超螺旋松弛環(huán)狀，非超螺旋是否與蛋白質(zhì)結(jié)合不結(jié)合共價(jià)結(jié)合對某些核酸酶抗性強(qiáng)，不容易被降解弱，容易被降解分離cccDNA和rcDNA的分子基礎(chǔ)分離cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差異乙肝病毒cccDNA檢測9cccDNArcDNA核酸一級結(jié)構(gòu)完整的雙鏈兩條鏈均不完整核二、HBV cccDNA檢測技術(shù)乙肝病毒cccDNA檢測10二、HBV cccDNA檢測技術(shù)乙肝病毒cccDNA檢測101

5、.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)2.侵入者探針法（Invader assaay）3.嵌合引物熒光PCR法現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介乙肝病毒cccDNA檢測111.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)現(xiàn)有的現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)2.侵入者探針法（Invader assaay）3.嵌合引物熒光PCR法乙肝病毒cccDNA檢測12現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介選擇性PCR(普通PCR設(shè)計(jì)一對特殊引物：跨雙缺口引物 正義引物P1 ：與負(fù)鏈互補(bǔ)結(jié)合，位于正 鏈缺口上游 反義引物P2 ：與正鏈互補(bǔ)結(jié)

6、合，位于負(fù) 鏈缺口下游目的：rcDNA不被擴(kuò)增1.選擇性PCR乙肝病毒cccDNA檢測13設(shè)計(jì)一對特殊引物：跨雙缺口引物1.選擇性PCR乙肝病毒cc選擇性PCR：rcDNA不被擴(kuò)增乙肝病毒cccDNA檢測14選擇性PCR：rcDNA不被擴(kuò)增乙肝病毒cccDNA檢測14選擇性PCR：cccDNA能被擴(kuò)增乙肝病毒cccDNA檢測15選擇性PCR：cccDNA能被擴(kuò)增乙肝病毒cccDNA檢測1PCR產(chǎn)物自身退火（self annealing）“選擇性”PCR：并非萬無一失乙肝病毒cccDNA檢測16PCR產(chǎn)物自身退火（self annealing）“選擇性 rcDNA被大量擴(kuò)增，陽性結(jié)果不可靠，定量

7、結(jié)果也不可靠 Hepatology Research 2003;15: 234-243（PBMC） World J Gastroenterol 2004;10(1):82-85(血清) Kock等：反應(yīng)管中rcDNA含量不能超過105copy Hepatology 1996;23:405-413 血清HBV rcDNA超過108copy/ml，進(jìn)行熒光PCR可能會出現(xiàn)檢測結(jié)果假陽性“選擇性”PCR：并非萬無一失乙肝病毒cccDNA檢測17 rcDNA被大量擴(kuò)增，陽性結(jié)果不可靠，定量結(jié)果也不可 與定性法比較增加了一個熒光探針，探針位于擴(kuò)增片段區(qū)（負(fù)鏈缺口下游），與cccDNA的負(fù)鏈互補(bǔ)。選擇性實(shí)

8、時熒光定量PCR檢測cccDNA乙肝病毒cccDNA檢測18 與定性法比較增加了一個熒光探針，探針位于擴(kuò)增片段區(qū)（rcDNA不能被擴(kuò)增無熒光信號EcoR I5+P1 P2 3200(1)53159031820P118201590+ 3200（1）EcoR I P2cccDNA能被擴(kuò)增檢測到熒光信號選擇性實(shí)時熒光定量PCR檢測cccDNA乙肝病毒cccDNA檢測19rcDNA不能被擴(kuò)增EcoR I5+P1 P2 32實(shí)時熒光定量PCR的原理乙肝病毒cccDNA檢測20實(shí)時熒光定量PCR的原理乙肝病毒cccDNA檢測20實(shí)時熒光定量PCR的原理乙肝病毒cccDNA檢測21實(shí)時熒光定量PCR的原理乙

9、肝病毒cccDNA檢測21實(shí)時熒光定量PCR的原理乙肝病毒cccDNA檢測22實(shí)時熒光定量PCR的原理乙肝病毒cccDNA檢測22 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程YCt= 42.0827-3.5554logXcopy 相關(guān)指數(shù)： R2=0.995 靈敏度至少可以達(dá)到103copy/ml 結(jié)果 ： 選擇性實(shí)時熒光定量PCR檢測cccDNA乙肝病毒cccDNA檢測23 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程YCt= 42.0827-3.5554logX同樣存在PCR產(chǎn)物自身退火引起的rcDNA 非特異性擴(kuò)增的問題由于靈敏度較普通PCR高，假陽性率比普 通PCR更高缺陷：選擇性實(shí)時熒光定量PCR檢測cccDNA乙肝病毒cccDNA檢測24同樣

10、存在PCR產(chǎn)物自身退火引起的rcDNA缺陷：選擇性實(shí)時質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品107copy/ml3.5108copy/ml攜帶者血清質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品105copy/ml105107copy/ml攜帶者血清選擇性實(shí)時熒光定量PCR檢測cccDNA乙肝病毒cccDNA檢測25質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品107copy/ml3.5108copy/ml攜解決方案 特異性抽提分離cccDNA與其它形式的病毒DNA 采用沉淀法或質(zhì)粒抽提試劑盒抽提法 酶切純化cccDNA 采用綠豆核酸酶或ATP依賴的plasmid-safe DNA酶選擇性實(shí)時熒光定量PCR檢測cccDNA乙肝病毒cccDNA檢測26解決方案 特異性抽提分離cccDNA與其它

11、形式的病毒DNA選1.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)侵入者探針法（Invader assaay）3.嵌合引物熒光PCR法現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介乙肝病毒cccDNA檢測271.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)現(xiàn)有的2.侵入者探針法(Invader assay)兩個體系： 兩種特殊的探針：invader probe和primary probe，后者含與待測模板無關(guān)的5側(cè)翼的堿基片段。 熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)：被核酸內(nèi)切酶 (cleavase,裂解酶)特異地切割5側(cè)翼堿基片段作為第二個invader，與熒光共振能量轉(zhuǎn)移盒（FRETC）結(jié)合，裂解酶切割F

12、RETC上含有熒光基團(tuán)的短臂，發(fā)出熒光信號。特點(diǎn)：一個模板可以重復(fù)使用，每“結(jié)合裂解結(jié)合裂解”一次為一個循環(huán)，每循環(huán)一次產(chǎn)生一個熒光信號，呈線性信號放大乙肝病毒cccDNA檢測282.侵入者探針法(Invader assay)兩個體系：乙肝乙肝病毒cccDNA檢測29乙肝病毒cccDNA檢測29乙肝病毒cccDNA檢測30乙肝病毒cccDNA檢測30侵入者探針法定量檢測cccDNA的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：線性信號放大，特異性比熒光 PCR法強(qiáng)缺點(diǎn)：靈敏度低：104copy/ml乙肝病毒cccDNA檢測31侵入者探針法定量檢測cccDNA的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：線性信號放大，1.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR

13、、熒光PCR)2.侵入者分析法（Invader assaay）嵌合引物熒光PCR法現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介乙肝病毒cccDNA檢測321.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)現(xiàn)有的3. 嵌合引物熒光PCR法Shao, et al. J Virol Methods 2003； 112：45-52+PNN：與HBVDNA非同源片段5N533p+rcDNAcccDNA乙肝病毒cccDNA檢測333. 嵌合引物熒光PCR法Shao, et al. J ViPNNP253533. 嵌合引物熒光PCR法乙肝病毒cccDNA檢測34PNNP253533. 嵌合引物熒光PCR法乙肝病毒

14、 嵌合引物熒光PCR的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：克服了熒光PCR法的部分缺陷，靈敏 度比侵入法提高 缺點(diǎn)：仍不能完全避免待測標(biāo)本中存在的 rcDNA被非特異性擴(kuò)增乙肝病毒cccDNA檢測35 嵌合引物熒光PCR的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：克服了熒光PCR法的部 無論是選擇性熒光PCR，還是侵入者探針法或嵌合引物熒光PCR，本身都不能解決在高rcDNA背景條件下的假陽性問題，必須結(jié)合抽提分離、酶切純化等步驟，以提高特異性。乙肝病毒cccDNA檢測36 無論是選擇性熒光PCR，還是侵入者探針法或嵌合引物熒三、影響cccDNA池的因素乙肝病毒cccDNA檢測37三、影響cccDNA池的因素乙肝病毒cccDNA檢測371.c

15、ccDNA池的自身恒定 cccDNA池：感染肝細(xì)胞核內(nèi)HBV cccDNA的 含量在無外來干擾的情況下保 持恒定(550copy/cell) 病毒自身調(diào)節(jié)：關(guān)于病毒的進(jìn)化 關(guān)于病毒的“思維” 病毒自身的調(diào)節(jié) 外來壓力：打破病毒含量自身恒定的結(jié)果乙肝病毒cccDNA檢測381.cccDNA池的自身恒定 cccDNA池：感染肝細(xì)胞核2.抗病毒藥物對cccDNA的影響現(xiàn)有抗病毒藥物，包括干擾素和各種核苷類似物，可以一過性地減少cccDNA，但均不能清除cccDNA細(xì)胞核內(nèi)cccDNA含量的相對穩(wěn)定性，決定了長療程抗病毒治療的必要性乙肝病毒cccDNA檢測392.抗病毒藥物對cccDNA的影響現(xiàn)有抗病毒藥物，包括干擾素3.肝外組織也是cccDNA的儲存池？肝外組織細(xì)胞中HBV標(biāo)志的存在情況：腎、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃腸黏 膜、皮膚、睪丸、前列腺、唾液腺 等組織或細(xì)胞中均檢測到HBV的標(biāo)志物HBV吸附？暫居？建立感染狀態(tài)？ 依據(jù)：從上述組織細(xì)胞中檢測到cccDNA， 但必須解決檢測技術(shù)問題乙肝病毒cccDNA檢測403.肝外組織也是cccDN