免疫檢測的技術(shù)

1、關(guān)于免疫檢測技術(shù)第1頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四免疫檢測是目前生物學(xué)檢測方法中用途最廣泛的一種方法。具有高度精確、靈敏、特異的特點(diǎn)。可用于免疫學(xué)的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究，也可應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。第2頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四 1 、免疫疾病診斷 2 、動物植物生理活動研究（激素、維生素） 3 、物種及微生物鑒定 4 、動物、植物性狀的免疫標(biāo)記 5 、免疫增強(qiáng)藥物和疫苗的研究 6 、發(fā)病機(jī)理研究 7 、分子生物學(xué)研究 免疫檢測技術(shù)在生物科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用：第3頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四第一節(jié) 抗原抗體

2、反應(yīng)原理 抗體能特異性地識別相應(yīng)的抗原，并與之結(jié)合。這種結(jié)合在體外也能發(fā)生，當(dāng)抗原和抗體在體外特異性結(jié)合后可出現(xiàn)肉眼可見或借助儀器可檢測出的反應(yīng)現(xiàn)象。 試驗時既可用已知抗體檢測標(biāo)本中有無相應(yīng)抗原，也可用已知抗原檢測標(biāo)本中有無相應(yīng)抗體。這種特性就是許多免疫檢測方法的基礎(chǔ)!第4頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四一、體外抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)特異性：抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性?？赡嫘裕嚎乖贵w反應(yīng)所形成的復(fù)合物較穩(wěn)定， 但在一定條件下可解離。（低酸、高鹽）比例性：抗原抗體的比例合適，才可出現(xiàn)可見的 反應(yīng)現(xiàn)象。（網(wǎng)格理論）階段性：特異性結(jié)合階段和可見反應(yīng)階段。第5頁，共53頁，2

3、022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四網(wǎng)格理論解釋抗原抗體形成沉淀的機(jī)制第6頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四網(wǎng)格學(xué)說（lattice theory）抗體過?？乖^?？贵w抗體比例合適抗原抗體第7頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四二、影響抗原抗體反應(yīng)的因素溫度：在一定溫度范圍內(nèi)，提高溫度可加速反應(yīng) 速度，縮短反應(yīng)時間，常用反應(yīng)溫度為37-45。溶液的pH：pH過高或過低可改變抗原和抗體理化 性質(zhì)，影響反應(yīng)結(jié)果，因此溶液的pH應(yīng)適宜 （pH 6-8）。電解質(zhì)：反應(yīng)中必須有適宜的電解質(zhì)（0.85%NaCl） 參與，否則不出現(xiàn)可見反應(yīng)。第8頁，共53

4、頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四三、抗原抗體反應(yīng)類型1.沉淀反應(yīng)2.凝集反應(yīng)3.補(bǔ)體參與的反應(yīng)4.中和反應(yīng)5.免疫標(biāo)記技術(shù)第9頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四第二節(jié) 常見免疫檢測方法可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、細(xì)胞裂解液或組織液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下形成肉眼可見的沉淀物稱沉淀反應(yīng)。一、免疫沉淀反應(yīng)第10頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四一、免疫沉淀反應(yīng) 1. 液相沉淀反應(yīng)2. 凝膠擴(kuò)散沉淀3. 凝膠免疫電泳絮狀沉淀環(huán)狀沉淀免疫濁度沉淀單向瓊脂擴(kuò)散試驗雙向瓊脂擴(kuò)散試驗血清免疫電泳火箭電泳對流免疫電泳免疫印跡等第11頁

5、，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四絮狀沉淀試驗操作步驟：（1） 將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。（2） 各管加入一定濃度的適量抗血清。（3） 振搖使抗原、抗體充分混勻，置37孵育。（4） 產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管。 絮狀沉淀試驗方法簡單，設(shè)備要求低，敏感度較低，目前多用以測定抗原抗體反應(yīng)的最適比。 第12頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四環(huán)狀沉淀試驗操作步驟：（1） 用毛細(xì)滴管吸取抗血清加于沉淀管（550mm）底部，避免產(chǎn)生氣泡。（已知?。?） 將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。（待測！ ）

6、（3） 置沉淀管于室溫下使其反應(yīng)，15min內(nèi)在兩界面間呈現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)為陽性。30min仍無沉淀環(huán)出現(xiàn)則為陰性。應(yīng)用：主要用于抗原的定性試驗。用已知抗體來檢測未知抗原。 （診斷炭疽的Ascoli實(shí)驗、細(xì)菌分型、血跡鑒定）。 第13頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四2. 凝膠擴(kuò)散沉淀凝膠擴(kuò)散沉淀是指抗原與抗體在凝膠介質(zhì)中自由擴(kuò)散形成濃度梯度，抗原與抗體在比例合適的擴(kuò)散部位相遇形成沉淀線的反應(yīng)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等。最常用的方法為： 單向瓊脂擴(kuò)散試驗 雙向瓊脂擴(kuò)散試驗第14頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四單向瓊脂擴(kuò)散

7、試驗 原 理： 將適當(dāng)濃度的抗體混入瓊脂凝膠中，瓊脂凝固后，打成小孔，加入待測的抗原物質(zhì)，使抗原在凝膠中由小孔自由向周圍擴(kuò)散，并在小孔周圍合適的位置與抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關(guān)。第15頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四 單向免疫擴(kuò)散試驗示意圖第16頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四雙向免疫擴(kuò)散試驗 雙向免疫擴(kuò)散試驗是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個小孔，在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體材料。當(dāng)抗原和抗體向四周凝膠中擴(kuò)散，在兩孔間可出現(xiàn)23條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測，或用于兩種抗原材料的抗原相關(guān)性分析。第17頁

8、，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四第18頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四3.免疫電泳技術(shù) 免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。這種技術(shù)有兩大優(yōu)點(diǎn)：一是加快了沉淀反應(yīng)的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應(yīng)，以此作更細(xì)微的分析。免疫電泳包括:血清免疫電泳、對流免疫電泳、火箭電泳、免疫印跡等 第19頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四血清免疫電泳將抗原混合物（病人血清）在凝膠中用電泳分離后，沿電泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，進(jìn)行雙向擴(kuò)散。沉淀線的特點(diǎn)顯示病人血清與正常人血清存在的差異，

9、即血清蛋白組分的缺少或增加。第20頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四免疫電泳原理圖解第21頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四火箭免疫電泳火箭免疫電泳技術(shù)又稱作單向電泳擴(kuò)散免疫沉淀試驗，它是由單向擴(kuò)散發(fā)展起來的一項定量技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是加速度的單向擴(kuò)散。第22頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四 沉淀線的高度與抗原量成正比火箭電泳圖第23頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四二、凝集反應(yīng)（Agglutination） 顆粒性抗原（如細(xì)菌、細(xì)胞）與相應(yīng)抗體，在適當(dāng)電解質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定時間后出現(xiàn)肉眼可見凝集

10、塊稱為凝集反應(yīng)。 1、直接凝集：將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。 2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表面，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。第24頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四第25頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四妊娠免疫診斷試驗 孕婦尿中，絨毛膜促性腺激素（HCG）含量明顯增高。（HCG是可溶性抗原 ）反之，非孕婦尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗體。 第26頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四三、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗（2個系統(tǒng)，5種成分）第27頁，

11、共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四已知抗原加入血清（檢測抗體）加入標(biāo)準(zhǔn)量補(bǔ)體加入包被抗體的紅細(xì)胞檢測紅細(xì)胞溶解情況AgPatientsserum AbNo AbAg三、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗（2個系統(tǒng)，5種成分）第28頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四免疫標(biāo)記技術(shù)是采用酶、熒光素、放射性核素等標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體所進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。免疫標(biāo)記技術(shù)既可對樣品作定性、定量檢測，也可進(jìn)行定位分析，且大大提高了方法的靈敏度，是目前應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測技術(shù)。四、免疫標(biāo)記技術(shù)第29頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四常見標(biāo)記免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免

12、疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 四、免疫標(biāo)記技術(shù)第30頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四 該法是用放射性核素作為標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體所進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)，盡管放射免疫技術(shù)需特殊儀器設(shè)備且有一定的放射性危害，但由于其具有高度的靈敏度（pg）和自動化檢測等特點(diǎn)，因此在實(shí)驗研究和臨床檢測中仍被廣泛應(yīng)用。主要用于激素、小分子藥物、腫瘤標(biāo)志物等小分子化合物的定量分析。1. 放射免疫技術(shù)（125I）第31頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四放射免疫分析基本原理競爭性結(jié)合反應(yīng)的經(jīng)典標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）與限量抗體(Ab)競爭性結(jié)合Ag*和Ag具有等同的與Ab

13、結(jié)合能力第32頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四 Ag* Ab Ag 標(biāo)記抗原 特異性抗體 待測抗原( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗體復(fù)合物分離Ag*-Ab 和游離Ag*從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀知含量 測定Ag*-Ab和游離Ag*放射性 放射免疫測定法(RIA)示意圖第33頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四RIA法原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線 7550 30 100110100 1000未標(biāo)記抗原濃度（ng/mL)結(jié)合/未結(jié)合的放射活性（%）Ag*-AbAg*第34頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四將熒光素（異硫氰酸熒光素或羅丹明等）

14、標(biāo)記抗體，制成熒光抗體診斷試劑。用熒光顯微鏡觀察熒光的產(chǎn)生或熒光強(qiáng)度，以此判斷抗原的存在、定位和分布情況。免疫熒光技術(shù)有直接法和間接法等。2. 免疫熒光技術(shù)第35頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四免疫熒光技術(shù)直接法Ag熒光素標(biāo)記的特異性抗體組織切片第36頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四免疫熒光技術(shù)間接法Ag熒光素標(biāo)記的抗抗體組織切片待測抗體第37頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四免 疫 熒 光 染 色 顯 示 細(xì) 胞 骨 架 免疫熒光染色是利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，用經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗體對細(xì)胞或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性

15、或定量研究的方法。該技術(shù)與熒光顯微鏡觀察相結(jié)合，可對特定的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞或組織內(nèi)的精確定位。常用于抗原、抗體標(biāo)記的熒光染料有以下幾種顯示綠色熒光：Fluorescein isothocyancie(FITC),Alexa-488顯示紅色熒光：Rhodamine B, Texas Red, Alexa-546,568,594顯示藍(lán)色熒光：Alexa350 用Alexa488標(biāo)記的抗人-tubulin抗體染色顯示微管(綠色); 細(xì)胞核: 紅色, DAPI染色人皮膚角化細(xì)胞免疫熒光染色用抗-tubulin抗體染色顯示微管(綠色); 細(xì)胞核: 紅色, DAPI染色(激光共聚焦顯微鏡照片)PtK1細(xì)胞免

16、疫熒光染色第38頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四本法是抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物的高效催化活性相結(jié)合的免疫檢測技術(shù)。酶標(biāo)記的抗原或抗體與待檢標(biāo)本中的相應(yīng)成分特異性結(jié)合，根據(jù)酶作用底物后的顏色變化，采用肉眼或酶標(biāo)檢測儀分析、判斷結(jié)果。常用方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗和酶免疫組化法，前者用于檢測可溶性抗原或抗體，后者常用于檢測組織中或細(xì)胞表面的抗原。3. 免疫酶測定法第39頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四是在固相載體（通常為聚苯乙烯反應(yīng)板）表面進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。實(shí)驗中常用的酶是辣根過氧化物酶（HRP），底物為二苯基聯(lián)苯胺。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELI

17、SA）：第40頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四ELISA試驗三個必要的試劑(1)固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）(2)酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）(3)酶作用的底物（顯色劑）第41頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四底物顯色定性或定量的分析原理包被反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234基本步驟第42頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四五種常見的檢測方法1 雙抗夾心法（測定抗原）2 測定抗體的間接法3 競爭法（測定抗原）4 捕獲包被法測IgM抗體 5 ABS-ELISA法

18、第43頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及低于二價的小分子單價抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心 1 雙抗夾心法測抗原第44頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四2 間接法測抗體第45頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四幾種標(biāo)記/檢測技術(shù)靈敏度的比較酶標(biāo)熒光放免發(fā)光靈敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-9第46頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四幾種標(biāo)記/檢測試劑的有效期比較酶標(biāo)熒光放免發(fā)光有效期（月）1815129630第47頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)53分，星期四020,00040,00060,00080,000100,000試劑盒儀器特殊防護(hù)治理污染人民幣人民幣三種免疫測定技術(shù)的成本及費(fèi)用三種免疫測定技術(shù)的成本及費(fèi)用放免酶標(biāo)發(fā)光第48頁，共53頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)