動物細胞工程制藥

1、關(guān)于動物細胞工程制藥第1頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四Robert Hooke 及其制作的顯微鏡第一節(jié) 概述第2頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四Leeuwenhoek首次觀察到了活的細胞第3頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四德國植物學家Schleiden和動物學家Schwann創(chuàng)立了細胞學說1885年Roux用生理鹽水成功培養(yǎng)雞胚組織1907年Harrison成功培養(yǎng)了離體的蛙胚神經(jīng)組織，并觀察到神經(jīng)細胞突起的生長過程。開創(chuàng)現(xiàn)代細胞培養(yǎng)的新紀元。第4頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四細

2、胞工程是以細胞為單位，按人們的意志，應用細胞生物學、分子生物學等理論和技術(shù)，有目的地進行精心設計，精心操作，使細胞的某些遺傳特性發(fā)生改變，從而達到改良或產(chǎn)生新品種的目的，以及使細胞增加或重新獲得產(chǎn)生某種特定產(chǎn)物的能力，從而在離體條件下進行大量培養(yǎng)、增殖，并提取出對人類有用的產(chǎn)品。第5頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四二、動物細胞的化學組成和代謝動物細胞的化學組成 無機成分：水、無機鹽 有機成分：蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸動物細胞的代謝 糖，脂肪和蛋白質(zhì)的代謝分為三個降解階段（大分子降解為小分子，小分子代謝產(chǎn)生三個主要的中間產(chǎn)物，中間產(chǎn)物進入三羧酸循環(huán)）第6頁，共113頁

3、，2022年，5月20日，12點37分，星期四三、動物細胞的生理特點細胞的分裂周期長：一般1248 h細胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象接觸抑制現(xiàn)象：指細胞在生長過程中達到相互接觸時停止分裂的現(xiàn)象。正常二倍體細胞的生長壽命是有限的:時間長短決定于細胞來源的種族和年齡 原代培養(yǎng) 有限細胞系 無限細胞系（連續(xù)細胞系）第7頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四動物細胞對周圍環(huán)境十分敏感 對理化因素敏感：如滲透壓、pH、離子強度、剪切力、微量元素等。動物細胞對培養(yǎng)基的要求高 必需氨基酸、維生素、無機鹽、微量元素、葡萄糖、細胞生長因子、貼壁因子等。動物細胞對蛋白質(zhì)的合成途徑和修

4、飾功能與細菌不同 第8頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四動物細胞生產(chǎn)藥物缺點：培養(yǎng)條件高、成本貴、產(chǎn)量低優(yōu)點：分泌胞外、收集純化方便，較完善的翻譯后修飾，與天然產(chǎn)品一致第9頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四第三節(jié) 生產(chǎn)用動物細胞的要求和獲得一、生產(chǎn)用動物細胞的要求二、生產(chǎn)動物細胞的獲得三、基因工程細胞的構(gòu)建和篩選四、常用生產(chǎn)用動物細胞的特性五、細胞庫的建立第10頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四一、生產(chǎn)用動物細胞的要求只有從正常組織中分離的原代細胞才能用來生產(chǎn)生物制品，如雞胚細胞、兔腎細胞等二倍體細胞，即使經(jīng)過多次傳

5、代也可用于生產(chǎn)，如WI-38，2BS細胞等用異倍體傳代細胞生產(chǎn)重組基因產(chǎn)品，如t-PA、EPO、因子等按照FDA對細胞株的要求，控制最終產(chǎn)品中DNA殘留量第11頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四二、生產(chǎn)用動物細胞的獲得原代細胞：直接取自動物組織、器官，經(jīng)過粉碎、消化而獲得的細胞懸液。如雞胚細胞、原代兔腎細胞或鼠腎細胞、淋巴細胞等用原代細胞生產(chǎn)生物制品常需要大量的動物，費錢費力第12頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四二倍體細胞系：原代細胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆，從多種細胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細胞株由于該類細胞壽命有限，一般從

6、動物的胚胎組織中獲取。如WI-38、MRC-5、2BS等第13頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四轉(zhuǎn)化細胞系：失去了正常細胞的特點，獲得了無限增殖的能力轉(zhuǎn)化細胞系具有無限生命力，常常倍增時間較短，對培養(yǎng)條件和生長因子等要求較低，更適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。如Namalwa、CHO、BHK-21、Vero細胞等第14頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四融合細胞系細胞融合：指兩個或兩個以上的細胞合并成一個細胞的過程目前常用的融合方法有：仙臺病毒融合法、聚乙二醇融合法、電融合法第15頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四仙臺病毒融合法

7、（很少使用）融合過程：病毒加入兩種細胞（4），附膜，細胞凝聚37，病毒與細胞膜反應，細胞膜被破壞兩細胞連接部穿通，周邊連接部修復細胞融合第16頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四聚乙二醇（PEG）融合法常用相對分子量為1000，濃度為50%，pH在8.08.2時融合率可達100%目前主要用于產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞的制備第17頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四電融合法：在短時間的強電場作用下，細胞膜發(fā)生可逆性的電擊穿，使相鄰細胞的細胞膜發(fā)生繼發(fā)性融合。優(yōu)點：操作簡單，無化學毒性、對細胞損傷小、融合同步、融合率高，可在顯微鏡下直接觀察決定因素：

8、電場強度、脈沖寬度、溫度、緩沖液的性質(zhì)（pH、離子強度、滲透壓）第18頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四重組工程細胞系可采用基因工程的手段構(gòu)建各種工程細胞第19頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四三、基因工程細胞的構(gòu)建和篩選1.真核細胞基因表達載體的構(gòu)建病毒載體：如牛痘病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)率病毒、桿 狀病毒等質(zhì)粒載體：穿梭質(zhì)粒載體第20頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四用桿狀病毒做載體的優(yōu)點該病毒基因組是雙鏈DNA，容易進行重組；插入78kb的DNA不影響正常病毒粒子的形成；多角體蛋白和病毒粒子的形成無直接關(guān)系，因此用外

9、源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子；多角體蛋白基因有非常強的啟動子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的2030%；用光學顯微鏡可看到多角體，容易以此為標記物來挑選陽性克??；如果用家蠶桿狀病毒，還可在蠶體直接表達外源基因。第21頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四構(gòu)建質(zhì)粒載體一般含有如下基本成分： 允許載體在細菌體內(nèi)擴增的質(zhì)粒序列。含有能使基因轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)控元件。 能用以篩選出外源基因已整合的選擇標記。僅適用于密切相關(guān)的突變細胞株，如tk基因顯性作用基因，如neo基因 有時還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴增系統(tǒng)。第22頁，共113頁，2022年，5月20日，12點3

10、7分，星期四2.基因載體的導入和高效表達工程細胞株的篩選 融合法 化學法 物理法 病毒法細胞融合法 DNA-磷酸鈣沉淀法 電穿孔法 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒介導法 脂質(zhì)體介導法 DEAE-葡聚糖法 顯微注射法 重組DNA病毒介導法 原生質(zhì)融合法 染色體介導法 基因槍法 多瘤病毒樣顆粒介導法 微細胞介導法鬼影紅細胞介導法DNA導入動物細胞的常用方法第23頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四磷酸鈣沉淀法：將溶解的DNA加在Na2HPO4中，逐漸加入CaCl2溶液，當 Na2HPO4和CaCl2形成沉淀，DNA包裹在沉淀中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀物，當沉淀物與細胞表面接觸時，通過吞噬

11、作用將DNA導入胞內(nèi)。優(yōu)點：方法簡單，可進行共轉(zhuǎn)化第24頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四電穿孔法：借助電穿孔儀產(chǎn)生的高壓脈沖電場，使細胞膜出現(xiàn)瞬時可逆性的小孔，外源DNA沿小孔進入細胞。特點：轉(zhuǎn)化效率較高，但進入的DNA拷貝數(shù)較低第25頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四如何篩選工程細胞？依靠構(gòu)建載體內(nèi)的選擇標記采用相應的篩選系統(tǒng)：如用HAT（次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）選擇系統(tǒng)，篩選tk+、hgprt+的轉(zhuǎn)化細胞；用G418（Geneticin）選擇系統(tǒng)，篩選neor的轉(zhuǎn)化細胞。對選出的細胞進行克隆和亞克隆使其純化。利用擴增系統(tǒng)，不斷增加

12、其基因拷貝數(shù)，獲得高效表達而穩(wěn)定的工程細胞株。第26頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四四、常用生產(chǎn)用細胞的特性（1）WI-38： 1961年來源于女性高加索人正常胚肺組織的二倍體細胞系。 該細胞是成纖維細胞，能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用BME（Eagles basal medium）加小牛血清，pH控制在7.2。細胞的倍增時間為24h，有限壽命為50代，上世紀60年代被廣泛用于制備疫苗。第27頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四（2）BHK-21： 1961年從5只生長1天的地鼠幼鼠的腎臟中分離的?，F(xiàn)在廣泛采用的是1963年用單細胞分離的方法經(jīng)13次的

13、克隆的細胞。 成纖維細胞，2n=44。通常用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，添加7%胎牛血清。過去多用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗，現(xiàn)在已被用于構(gòu)建工程細胞。第28頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四（3）Vero： 1962年來源于正常的成年非洲綠猴腎。 是貼壁依賴的成纖維細胞，2n=60，高倍體率為1.7%，可持續(xù)地進行培養(yǎng)。通常用的培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，添加5%胎牛血清。該細胞可支持多種病毒的增殖，包括脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病病毒，已被批準用于人體。第29頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四（4）Namalwa： 1972年來源于肯

14、尼亞患有Burkitt淋巴瘤的病人體中，后在瑞典構(gòu)建的一株人的類淋巴母細胞。 該細胞有2.8%的高倍體率，多數(shù)細胞有1214條標記染色體，單條X染色體，無Y染色體。通常用的培養(yǎng)基為RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于大規(guī)模生產(chǎn)-干擾素。第30頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四五、細胞庫的建立用于生產(chǎn)的工程細胞必須建立兩個細胞庫：1. 原始細胞庫（master cell bank， MCB）2. 生產(chǎn)用細胞庫（manugactures working cell bank，MWCB），或稱工作細胞庫（working cell bank， WCB）。第31頁，共113

15、頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四原始細胞庫是單一來源的均質(zhì)的細胞，對于二倍體細胞應該是群體倍增水平盡可能低的細胞。貯存時須有該細胞的詳細檔案，包括：該細胞系的歷史：來源、年齡和性別、細胞分離的方法、所用的培養(yǎng)材料等；該細胞系的特性：形態(tài)、生長的特性、種源的特性等；對各種有害因子檢查的結(jié)果。第32頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四生產(chǎn)用細胞庫：從原始細胞庫來，或從單一安瓿來，或從多個安瓿在融化即刻混合在一起的，然后經(jīng)培養(yǎng)擴增到一定數(shù)量后，再分裝儲存形成的細胞庫。生產(chǎn)用細胞庫也必須建立檔案，而且需要進行無菌性和無細胞交叉污染的檢查，生產(chǎn)時需確定其最高使用的

16、傳代數(shù)。第33頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四第四節(jié) 動物細胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基培養(yǎng)成功必備條件：所有與細胞接觸的設備、器材和溶液，都必須保持絕對無菌，避免細胞外微生物的污染必須有足夠的營養(yǎng)供應，絕對不可有有害的物質(zhì)，避免即使是極微量的有害離子的摻入保證有適量的氧氣供應需要隨時清除細胞代謝中產(chǎn)生的有害產(chǎn)物有良好的適于生存的外界環(huán)境及時分種，保持合適的細胞密度第34頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四一、動物細胞的培養(yǎng)條件器材的清洗和消毒水質(zhì)pH滲透壓溫度空氣第35頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四1. 器材的清洗和消

17、毒（1）器材的清洗：浸泡（3%磷酸三鈉）刷洗泡酸（重鉻酸鉀、硫酸、水）沖洗（自來水、蒸餾水、去離子水）（2）器材的消毒滅菌： 物理方法：如紫外線、干熱、濕熱、過濾 化學方法：如化學消毒劑、抗生素第36頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四2. 水質(zhì)細胞培養(yǎng)的水必須進行特殊的處理，才能使用。除微生物、有毒元素、金屬離子、熱原質(zhì)當前處理水質(zhì)的方法有：蒸餾、離子交換、電滲透、反滲透、中空纖維過濾等第37頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四3. pH動物細胞培養(yǎng)的最適pH為7.27.4，低于6.8或高于7.6會對細胞產(chǎn)生不利影響，嚴重時可引起細胞退變甚至死

18、亡。培養(yǎng)基應具有一定的緩沖能力，必須加入緩沖系統(tǒng)： 如HEPES、 Na2HPO4/ NaH2PO4緩沖系統(tǒng)、 NaHCO3/CO2緩沖系統(tǒng)等第38頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四4. 滲透壓細胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細胞對滲透壓有一定耐受性。最理想的滲透壓為290300mOsm/kg為調(diào)整培養(yǎng)液的滲透壓，一般采用加減NaCl的方法： 1mg/ml NaCl-32mOsm/kg在細胞培養(yǎng)操作中，為保持合適的滲透壓和pH，一般都使用平衡鹽溶液（BBS），由無機鹽和葡萄糖組成。第39頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四5. 溫度動物細胞

19、最佳培養(yǎng)溫度：370.5昆蟲細胞最佳培養(yǎng)溫度：27 溫度過高：細胞退變甚至死亡溫度過低：降低代謝和生長速度，影響產(chǎn)量第40頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四6. 空氣方瓶和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)時，保持瓶內(nèi)有足夠的空間，即培養(yǎng)的液體量不超過總體積的30%。采用生物反應器需通氣，采用不同比例的O2、N2、CO2和空氣。第41頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四無毒、無污染體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有任何抵抗能力，因此培養(yǎng)基應達到：無化學物質(zhì)污染無微生物污染（如細菌、真菌、支原體、病毒等）無對細胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補體）對于

20、天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應當嚴格選材，嚴格操作對于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配置過程，配制所用的水、器皿應十分潔凈，配置后應嚴格過濾除菌。第42頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四二、動物細胞培養(yǎng)基的種類和組成1.天然培養(yǎng)基指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。缺點：成分復雜，制作過程復雜，組分不穩(wěn)定，批間差異大，來源有限，不適于大量培養(yǎng)和生產(chǎn)的需要，逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。第43頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四2.合成培養(yǎng)基優(yōu)點：成分明確，組分穩(wěn)定，可大量

21、生產(chǎn)供應其組成大致如下：氨基酸：是細胞合成蛋白質(zhì)的原料。所有細胞都需要12種必需氨基酸：纈、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精、胱。 此外還需要谷氨酰胺，它在細胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的來源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質(zhì)。第44頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四維生素：主要是形成酶的輔酶、輔基，維持細胞生命活動的低分子活性物質(zhì)。脂溶性（A、D、E、K），水溶性維生素（C、B1、B2、B12、生物素、葉酸、膽堿）等都是常用的成分。糖類:培養(yǎng)中的細胞可以進行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是也是合成某些

22、氨基酸、脂肪、核酸的原料。細胞對葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。第45頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四無機鹽：保持細胞的滲透壓，緩沖pH的變化，并積極參與細胞的代謝。細胞生長除需Na、K、Ca、Mg、N、P等基本元素，還需要Fe、Cu、Zn、Mn等微量元素。其它成分：有些合成培養(yǎng)基中還加有核酸的前體、氧化還原劑等。一般都需要加入510%的小牛血清。 除了以上與細胞生長有關(guān)的物質(zhì)以外，培養(yǎng)基中一般還要加入一種pH指示劑酚紅。當溶液酸性時pH6.8呈黃色，當溶液堿性時pH8.4呈紅色。第46頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四血清的主要成分血清

23、是由血漿去除纖維蛋白而形成的，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等第47頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四血清的種類小牛血清：取自出生10-30天的小牛新牛血清：取自出生24h之內(nèi)的新生牛胎牛血清：取自剖腹產(chǎn)的胎牛，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。第48頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四血清的外觀好的血清應該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性。若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時有溶血現(xiàn)象。

24、搖晃時感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。第49頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四血清的作用機制提供有利于細胞生長增殖所需的各種生長因子和激素提供有利于細胞貼壁所需的貼附因子和伸展因子提供可識別金屬、激素、維生素和脂質(zhì)的結(jié)合蛋白提供細胞生長所必需的脂肪酸和微量元素提供良好的pH緩沖系統(tǒng)第50頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四3.無血清培養(yǎng)基優(yōu)點：提高了細胞培養(yǎng)的可重復性，避免了由于血清批次之間差異的影響；減少了由血清帶來病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險；供應充足、穩(wěn)定；細胞產(chǎn)品容易純化；避免了血清中某些因素對有些細胞的毒性；減少了

25、血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于實驗結(jié)果的分析。第51頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四無血清培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基+不同種類的添加劑添加劑大致有以下幾類：激素和生長因子： 各種激素、生長因子的功能 維持細胞的功能 保持細胞的狀態(tài)（分化或未分化） 使用最多的是胰島素，促進糖原和脂肪酸的合成，對細胞生長有刺激作用。無血清培養(yǎng)基第52頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四結(jié)合蛋白：最經(jīng)常被補充的是鐵傳遞蛋白和白蛋白。為了便于純化，有時可用硫酸亞鐵、檸檬酸鐵、葡萄糖酸鐵代替鐵傳遞蛋白。貼附和伸展因子：目前多數(shù)無血清培養(yǎng)基只適用于懸浮細胞，真正能用以培養(yǎng)

26、貼壁細胞的很少，也很貴，原因在于它們均缺少必需的貼附和伸展因子。除貼附因子（纖維結(jié)合蛋白、膠原）、多肽生長因子，有的還添加維生素A酸和重組的小肽，它可與細胞的受體結(jié)合。其它有利于細胞生長的因子和元素：它們包括有消除氧自由基損害的谷胱甘肽，某些微量元素，如硒等。第53頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四如何選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基沒有一定的標準，有幾點建議可供參考：建立某種細胞株所用的培養(yǎng)基應該是培養(yǎng)這種細胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I，或在購買細胞株時咨詢。根據(jù)細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng)基。用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標

27、判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法。第54頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四培養(yǎng)細胞的種類： 原代細胞培養(yǎng) 傳代細胞培養(yǎng)培養(yǎng)基不同： 液體培養(yǎng) 固體培養(yǎng)培養(yǎng)容器和方式不同： 靜止培養(yǎng) 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 微載體培養(yǎng) 中空纖維培養(yǎng) 固定化培養(yǎng)第五節(jié) 動物細胞培養(yǎng)的基本方法第55頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四一、細胞分離離心分離法：主要用于從含有細胞的體液，如血液、羊水、胸腹水中分離細胞，8001000 r/min離心510min消化分離法：將生物體的組織塊剪碎-用消化液消化，使組織松散成細胞懸液-用緩沖液洗滌、離心、去除殘留的消化液-

28、獲得所需細胞第56頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四消化液的用途：取材進行原代培養(yǎng)時需要將組織塊消化解離形成細胞懸液；傳代培養(yǎng)時將貼壁細胞從瓶壁上消化下來。常用的消化液:胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、胰酶-檸檬酸鹽、胰酶-EDTA、膠原酶、鏈酶蛋白酶、木瓜蛋白酶等第57頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四二、細胞計數(shù)自動細胞計數(shù)器計數(shù)原理：讓一定體積的細胞懸液流經(jīng)一個小孔，并在兩個電極間通過，此時通過的細胞就會對電極間的電流產(chǎn)生干擾而使電壓發(fā)生改變，這樣就會在電子計數(shù)器上形成一個信號被記錄下來。優(yōu)點：計數(shù)速度快缺點：無法分辨活細胞和死細胞

29、，誤將細胞結(jié)團記錄為單個細胞，使計數(shù)值偏低第58頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四血球計數(shù)板計數(shù)第59頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四2.血球計數(shù)板計數(shù)臺酚藍染色：死細胞呈藍色苯胺黑染色：負染色法，細胞本身不染色第60頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四結(jié)晶紫染色細胞核計數(shù)法原理：結(jié)晶紫染液屬堿性染料，低滲，有螯合鈣離子的作用，可使細胞分散解離和破碎，將細胞核染成藍色。染色后取樣在血球計數(shù)板上鏡檢，計數(shù)細胞核即細胞數(shù)。第61頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四MTT染色計數(shù)法MTT:3-(4，

30、5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。 原理：活細胞內(nèi)的線粒體脫氫酶能將MTT轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙募着H結(jié)晶，可溶于二甲亞砜（DMSO）。 MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。用酶標儀在490nm處測定其吸光值，可間接反映活細胞數(shù)量。靈敏度高；MTT有致癌性，DMSO極易滲透皮膚第62頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四三、細胞傳代懸浮細胞的傳代：加入一倍或幾倍的生長液，然后分種兩只或多只培養(yǎng)瓶貼壁細胞的傳代：先消化再分種第63頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四貼壁細胞傳代的注意事項消化前確定細胞有無

31、污染加入消化液量要適當，搖動時能蓋滿單層細胞即可消化時間不宜過長，室溫靜置2-5min終止消化要先去掉消化液，然后加入有血清的培養(yǎng)基分種數(shù)量取決于細胞數(shù)和細胞特性，多數(shù)以20-30萬個/ml，每次1傳2或1傳3為宜；已培養(yǎng)過的瓶子可再次使用，但不要超過2-3次二倍體細胞每次傳代時應寫上傳代次數(shù)傳代后每天或隔一天換液，3-5d傳代一次第64頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四四、細胞的凍存和復蘇1.細胞的凍存采用液氮低溫（-196）凍存：加保護劑如甘油和二甲亞砜；冷凍速度以1/min的速度下降為宜注意事項：凍存前一天換液培養(yǎng)；細胞密度以1-2106個/ml為宜；凍存用培養(yǎng)

32、基應與實際使用的一致，DMSO過濾除菌；檢查安踣的密封性；標簽要寫上細胞名稱，編號和凍存日期。第65頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四2.細胞的復蘇（總的要求是快融）注意事項：操作中注意防護，戴面罩和手套；從液氮中取出后，立即丟入37-40溫水的搪瓷杯中，并攪動加速融化；用乙醇消毒安踣外表；盡早除去二甲亞砜，離心，換新鮮培養(yǎng)液；隔天觀察細胞生長情況，再換液一次。第66頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四一、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法二、動物細胞培養(yǎng)的操作方式第六節(jié) 動物細胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式第67頁，共113頁，2022年，5月20日，12

33、點37分，星期四一、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法依細胞種類： 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)依培養(yǎng)基： 液體培養(yǎng) 固體培養(yǎng)第68頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四依培養(yǎng)容器和方式： 靜止培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、 攪拌培養(yǎng)、微載體培養(yǎng) 中空纖維培養(yǎng)、 固定床或流化床培養(yǎng)第69頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四從生產(chǎn)實際分為： 懸浮培養(yǎng) 貼壁培養(yǎng) 貼壁-懸浮培養(yǎng)第70頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四1.懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)：即讓細胞自由地懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖。適用 于一切種類的非貼壁依賴性細胞（懸浮細胞）， 也適用于兼性貼壁細胞。優(yōu)點：操作簡便

34、，培養(yǎng)條件比較單一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易擴大培養(yǎng)規(guī)模，在培養(yǎng)設備的設計和實際操作中可借鑒細菌發(fā)酵的經(jīng)驗；可連續(xù)收集部分細胞進行移植繼代培養(yǎng)，傳代時無需消化分散，免遭酶類、EDTA及機械損害；細胞收率高，并可連續(xù)測定細胞濃度，還有可能實現(xiàn)大規(guī)模直接克隆培養(yǎng)。缺點：細胞體積較小，較難采用灌流培養(yǎng)，細胞密度較低第71頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四培養(yǎng)過程中，為確保細胞呈單顆粒均勻懸浮狀態(tài)，需采用攪拌或氣升式反應器，以較低攪拌速度及一定速度通入含5%CO2的無菌空氣，保持細胞懸浮狀態(tài)并維持培養(yǎng)液溶解氧和pH。不同細胞懸浮條件不同。為使細胞不致凝集、成團或沉淀，在配制培養(yǎng)基

35、的基礎鹽溶液中不加鈣和鎂離子。間歇或連續(xù)更換部分培養(yǎng)液，可維持pH值，若使用HEPES緩沖鹽溶液可不必連續(xù)通入含5%CO2的空氣。第72頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四2.貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)：是必須讓細胞貼附在某種基質(zhì)上生長繁 殖的培養(yǎng)方法。適用于一切貼壁依賴性 細胞，也適用于兼性貼壁細胞。優(yōu)點：適用的細胞種類廣，較容易采用灌流培養(yǎng)缺點：操作麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的面積，傳代或擴大培養(yǎng)時需先消化，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。第73頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四3.貼壁-懸浮培養(yǎng)（假懸浮培養(yǎng)）微載體培養(yǎng)包埋和微囊培養(yǎng)結(jié)團培養(yǎng)第

36、74頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四（1）微載體培養(yǎng)微載體培養(yǎng)法：將動物細胞吸附于微載體表面，在培養(yǎng)液中進行懸浮培養(yǎng)，使細胞在微載體表面長成單層的培養(yǎng)方法，或稱微珠培養(yǎng)法。制備微載體的材料主要有： 葡聚糖 明膠 玻璃 纖維素等第75頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四微載體培養(yǎng)的優(yōu)點：既可創(chuàng)造相當大的貼附面積供細胞貼附生長增殖，滿足絕大多數(shù)細胞的基本要求，又由于載體體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細胞自由懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)，充分發(fā)揮了懸浮培養(yǎng)的一切優(yōu)點。第76頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四理想微載體需具備的條

37、件微載體表面性質(zhì)與細胞有良好的相容性；微載體的材料無毒性；微載體的材料是惰性材料；材料比重為1.030-1.045g/ml；粒徑60-250m（溶脹后），大小均一；具有好的光學透明性；基質(zhì)的性質(zhì)是軟性的；可耐120高溫，便于采用高壓蒸汽滅菌原料充分，制作簡便，價格低廉，可反復使用第77頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四從固體微載體發(fā)展到多孔微載體（porous microcarrier）或多孔微球：極大增大了供細胞貼附的比表面積，同時適用于懸浮細胞的培養(yǎng)。第78頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四（2）包埋和微囊培養(yǎng)包埋法：將細胞包埋于瓊脂、瓊

38、脂糖、膠原及血纖維等海綿狀基質(zhì)中微囊法：由包埋法衍生而來，將包埋的顆粒經(jīng)液化處理而成為微囊可用于包埋細胞的載體材料：人工合成的高分子聚合物（聚丙烯酰胺、環(huán)氧樹脂、聚氨基甲酸酯、聚乙烯醇等）、糖類（如纖維素、瓊脂、瓊脂糖、K-卡拉膠、海藻酸鈣、殼聚糖等）、蛋白質(zhì)（如膠原、明膠、纖維蛋白等）第79頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四包埋或微囊培養(yǎng)法的優(yōu)點包埋或包裹在載體或微囊內(nèi)的細胞可獲得保護，避免了剪切力的損害。可以獲得較高的細胞密度，一般都在107-108個/ml以上。當控制微囊膜的孔徑后，可使產(chǎn)品濃縮在微囊內(nèi)，從而有利于下游產(chǎn)物的純化?？刹捎枚喾N生物反應器進行大規(guī)模培

39、養(yǎng)。第80頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四（3）結(jié)團培養(yǎng)利用細胞本身作為基質(zhì)，相互貼附后，再用懸浮的方法培養(yǎng)，可獲得高密度的細胞。優(yōu)點：操作簡便，節(jié)省了用于微載體的成本第81頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四二、動物細胞培養(yǎng)的操作方式分批式操作補料-分批（或流加式）操作（細菌生產(chǎn)中常用）半連續(xù)式操作連續(xù)式操作（個別情況下用于懸浮細胞的培養(yǎng)）灌流式操作第82頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四1.分批式操作將細胞和培養(yǎng)基一次性加入反應器內(nèi)進行培養(yǎng)，此后細胞不斷增長，產(chǎn)物不斷形成和積累，最后將條件培養(yǎng)基，即經(jīng)培養(yǎng)已含有細

40、胞產(chǎn)物的培養(yǎng)基，或連同細胞一并取出，培養(yǎng)結(jié)束。先將細胞和培養(yǎng)基加入反應器，待細胞生長至一定密度后，向反應器內(nèi)加入誘導劑或病毒等，經(jīng)一段時間作用后，將反應物取出。第83頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四2.半連續(xù)式操作定義：當細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時間，取出部分培養(yǎng)物，或單純是條件培養(yǎng)基，或連同細胞、載體一起，然后補充同樣數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基，或另加新鮮載體，繼續(xù)培養(yǎng)。優(yōu)點：操作簡便，生產(chǎn)效率高，可長期進行生產(chǎn)，反復收獲產(chǎn)品，而且可使細胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。第84頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37

41、分，星期四3.灌流式操作定義：當細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時不斷地補充新鮮培養(yǎng)基。但細胞留在反應器內(nèi)，使細胞處于一種不斷的營養(yǎng)狀態(tài)。第85頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四細胞可處在較穩(wěn)定的良好的環(huán)境中，營養(yǎng)條件好，有害代謝廢物濃度低；可極大地提高細胞密度，從而極大地提高了產(chǎn)品產(chǎn)量；產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間縮短，可及時收留在低溫下保存，有利于產(chǎn)品質(zhì)量的提高；培養(yǎng)基的比消耗率較低，加之產(chǎn)量質(zhì)量的提高，生產(chǎn)成本明顯降低。灌流式操作的優(yōu)點第86頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四一、動物細胞生物

42、反應器的類型二、動物細胞生物反應器的檢測控制系統(tǒng)第七節(jié) 動物細胞生物反應器第87頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四生物反應器必備條件制造生物反應器所采用的一切材料，尤其是與培養(yǎng)基、細胞直接接觸的材料，對細胞必須是無毒性的生物反應器的結(jié)構(gòu)必須使之具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能密封性能良好，可避免一切外來的不需要的微生物的污染對培養(yǎng)環(huán)境中多種物理化學參數(shù)能自動檢測和調(diào)節(jié)控制，控制的精確度高，能保持環(huán)境質(zhì)量的均一第88頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四可長期連續(xù)運轉(zhuǎn)容器加工制造時要求內(nèi)面光滑，無死角，以減少細胞或微生物的沉積拆裝、連接和清潔方便，

43、耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修設備成本盡可能低生物反應器必備條件第89頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四按規(guī)模大小可分為：實驗室規(guī)模：20L，用于培養(yǎng)工藝的研究;中試規(guī)模：20100L，提供一定量的產(chǎn)品，供純化、臨床前的各種檢測和臨床觀察，也包括進一步的工藝優(yōu)化實驗;生產(chǎn)規(guī)模：100L，用于生產(chǎn)，提供產(chǎn)品。動物生物反應器第90頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四一、動物細胞生物反應器的類型攪拌罐式生物反應器氣升式生物反應器透析袋或膜式生物反應器中空纖維生物反應器固定床或流化床式生物反應器第91頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，

44、星期四二、動物細胞生物反應器的檢測控制系統(tǒng)培養(yǎng)過程中需檢測的物化參數(shù)：有些需要在線檢測，如溫度、pH、攪拌速度、溶氧等；有些則需要取樣離線檢測，如活細胞數(shù)、氨基酸濃度分析、葡萄糖乳酸和銨離子的檢測等，有些則需在檢測后計算后才能獲得，如細胞的群體倍增時間、細胞的比增長率、葡萄糖消耗率、乳酸產(chǎn)率、生物反應器生產(chǎn)率等。第92頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四 動物細胞對攪拌引起的剪切力和氣泡很敏感，要保持所需的溶氧很困難，常采用的措施有：改變進氣的組成：不同比例的O2、N2、CO2和空氣加大通氣流量適當提高轉(zhuǎn)速在反應器外通氣加入血紅蛋白適當提高罐壓第93頁，共113頁，20

45、22年，5月20日，12點37分，星期四一、動物細胞產(chǎn)品常用的純化方法二、動物細胞產(chǎn)品的質(zhì)量要求第八節(jié) 動物細胞產(chǎn)品的純化方法和質(zhì)量要求第94頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四下游純化工作費錢、難度大成分復雜：工程細胞表達的產(chǎn)品，常常和細胞內(nèi)容物、培養(yǎng)基成分，特別當采用有血清培養(yǎng)基時小牛血清中的各種蛋白成分都將與產(chǎn)物混雜在一起，這些成分的物化性質(zhì)常常和目的產(chǎn)物非常相似，因此很難將他們分離開作用于人體的藥物純度要求高：由于產(chǎn)品多數(shù)用于人體，為防雜質(zhì)對人體的有害作用，對產(chǎn)品的純度要求很高第95頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四大多數(shù)動物細胞表達的

46、產(chǎn)物產(chǎn)量低，生物活性不穩(wěn)定，因此要求純化過程中所有的操作都應該非常溫和、精細，包括溶液的溫度、pH和鹽離子強度等都需要嚴格控制，要有相當精密的設備和檢測儀器。由于細胞產(chǎn)品多種多樣，它們的氨基酸組成、結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量大小和等電點等都不盡相同，因此分離純化技術(shù)的通用性差，必須根據(jù)每一種產(chǎn)品的特點研究開發(fā)出適合于該產(chǎn)品的專用的分離純化技術(shù)。第96頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四一、動物細胞產(chǎn)品常用的純化方法離心（低溫離心）離子交換層析凝膠層析親和層析鹽析和有機溶劑沉淀透析高壓液相層析第97頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四鹽析和有機溶劑沉淀鹽析

47、：溶液中加入無機鹽類，破壞蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜，使蛋白質(zhì)溶解度降低而析出。最常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等。調(diào)節(jié)鹽濃度和pH常同時使用。鹽析時蛋白不易變性，結(jié)束后需要進行透析、超濾脫鹽。有機溶劑沉淀：加入與水可混溶的有機溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，也可使蛋白質(zhì)沉淀。為了避免蛋白質(zhì)變性必須在低溫下操作。第98頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四透析原理：蛋白質(zhì)分子較大，不能通過半透膜，可以據(jù)此將蛋白質(zhì)與相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)分開。第99頁，共113頁，2022年，5月20日，12點37分，星期四高壓液相層析（HPLC，high-pressure liquid chromatography） 使用顆粒極細的介質(zhì)，在高壓下分離蛋白質(zhì)或其他分子混合物的層析技術(shù)。 柱效比經(jīng)典柱色譜柱高。在色譜柱出口處常常配以高靈敏度的監(jiān)測器，以及自動描記、分布收集的裝置，并用計算機進行色譜條件的設定及數(shù)據(jù)處理。 第100頁，共113頁，2022年，5月20日