脆弱類(lèi)桿菌熒光定量PCR法檢測(cè)

1、脆弱類(lèi)桿菌熒光定量PCR法檢測(cè)【關(guān)鍵詞】脆弱類(lèi)桿菌；熒光定量PR；SYBR,Green,I摘要：目的討論熒光定量PR技術(shù)檢測(cè)脆弱類(lèi)桿菌。方法用特異性引物和熒光染料實(shí)時(shí)PR擴(kuò)增并檢測(cè)產(chǎn)物。結(jié)果脆弱類(lèi)桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(AT25285)和4株別離株均有特異擴(kuò)增曲線，靈敏度達(dá)102個(gè)菌；而大腸埃希菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌無(wú)特異擴(kuò)增曲線。結(jié)論熒光染料實(shí)時(shí)PR技術(shù)可特異并定量檢測(cè)脆弱類(lèi)桿菌關(guān)鍵詞：脆弱類(lèi)桿菌；熒光定量PR；SYBRGreenIDetetinbateriafragilebySYBRGreenreal-tiePRAbstrat：bjetiveTidentifythebateriafragile

2、s(B.fragiles)by16StargetrRNArealtiePR.ethdsApairfspeifipriersasdesigned.ThePRprdutseredetetedbyfluresentquantifiativerealtiePR.ResultsTheB.fragilisAT25285and4separativestrainsfB.fragilisappearedinthespeialaplifiatinprduturve,hileE.li,L.bulgariusandS.therphilusdidnt.ThefluresentqantifiativePRandetet1

3、02bateria.nlusin16SrRNAtargetedprierandfluresentquantifiverealtiePRanbeappliablefrtheidentifiatinandquantifiatinfB.fragilis.Keyrds：bateriafragile;fluresentquatititivePR;SYBRGreenI脆弱類(lèi)桿菌是G-性無(wú)芽孢厭氧菌中最常見(jiàn)臨床別離株，常規(guī)厭氧培養(yǎng)別離需27d，不能及時(shí)指導(dǎo)臨床區(qū)分病原菌。細(xì)菌分子生物學(xué)技術(shù)的開(kāi)展為檢測(cè)細(xì)菌感染提供了早期特異敏感的檢測(cè)方法1。本文采用熒光定量PR檢測(cè)脆弱類(lèi)桿菌的16SrRNA基因。結(jié)果報(bào)告如下

4、。1材料與方法11材料111菌株與培養(yǎng)脆弱類(lèi)桿菌AT25285復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院；脆弱類(lèi)桿菌臨床別離株4株，選用擬桿菌Bd培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)鑒定；保加利亞乳桿菌I6047、嗜熱鏈球菌I6038、大腸埃希菌AT25922各1株，選用雙歧桿菌BL培養(yǎng)基培養(yǎng)。112儀器與試劑定量PR擴(kuò)增儀及配套分析軟件GeneAp5700,美國(guó)Perkin-Eler公司，離心機(jī)；細(xì)菌基因組提取試劑盒、ExTaqDNA聚合酶、10緩沖液、SYBRPreixExTaqTperfetReal-tie熒光染料TakaRa寶生物工程大連。12方法121引物設(shè)計(jì)在16SrRNA序列中第831-864位點(diǎn)和982-1007位點(diǎn)，通過(guò)分析

5、軟件Blast(nbinlnihgv)同GenBank中大腸埃希菌等基因序列相比擬，參照文獻(xiàn)2設(shè)計(jì)特異性引物。正向引物：F:5-gaaagattaagtattatg-3；反向引物：R:5-ggtgattggtatgaa-3，由TakaRa寶生物工程大連合成。122特異性測(cè)定分別取不同試驗(yàn)菌增菌培養(yǎng)液，按提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)展細(xì)菌基因提取，使每1l提取液中含有106個(gè)細(xì)菌的DNA，進(jìn)展熒光定量PR。123靈敏度測(cè)定將標(biāo)準(zhǔn)株菌液計(jì)數(shù)為109/l，倍比稀釋使每1l提取液中含有107,106,105,104,103,102,10,1個(gè)細(xì)菌的DNA，進(jìn)展熒光定量PR。擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線用配套分析軟件中的D

6、issiatinPrtl程序制圖和分析。124SYBRGreen嵌和熒光染料實(shí)時(shí)PR反響體系及條件10Buffer含SYBRGreen染料g2+dNTPTaq酶5l；正反向引物各02l10l；待檢樣品1l，加水34l混勻后，按9510s，955s，6034s，共進(jìn)展40個(gè)循環(huán)。2結(jié)果21特異性PR結(jié)果顯示，5株脆弱類(lèi)桿菌均有特異擴(kuò)增曲線，而大腸埃希菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌無(wú)特異擴(kuò)增曲線。22靈敏度圖1圖1可見(jiàn)，熒光信號(hào)強(qiáng)度Rn維持在基線0對(duì)應(yīng)的橫線上，15個(gè)循環(huán)后，Rn開(kāi)場(chǎng)上升。107，106，105的擴(kuò)增曲線在30個(gè)循環(huán)后到平臺(tái)期，104,103,102的擴(kuò)增曲線在3840個(gè)循環(huán)時(shí)到平

7、臺(tái)期。靈敏度達(dá)102個(gè)菌。自左向右的擴(kuò)增曲線為：107,106,105,104,103,102,101l圖1不同菌數(shù)的脆弱類(lèi)桿菌標(biāo)準(zhǔn)株熒光定量PR擴(kuò)增圖略23融解曲線圖2圖2可見(jiàn)，主峰為特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，從10510細(xì)菌含量的主峰峰值逐個(gè)降低，但位置一致；主峰前的小峰79處,可能是很少量的引物二聚體形成而致,并隨細(xì)菌含量模板量降低，主峰與小峰的峰值差減校自上向下的峰線為105,104,103,102,101l圖2擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線略3討論本文結(jié)果顯示，前引物序列831864在脆弱類(lèi)桿菌中完全互補(bǔ)，而與大腸埃希菌等互補(bǔ)序列不多；序列9821007為脆弱類(lèi)桿菌特有序列，其他細(xì)菌沒(méi)有與之相對(duì)應(yīng)的序列。

8、熒光定量PR說(shuō)明，5株脆弱類(lèi)桿菌有擴(kuò)增產(chǎn)物，采用一樣引物用rPR擴(kuò)增，在預(yù)計(jì)區(qū)域有擴(kuò)增條帶3，2種方法結(jié)果一致，可與大腸埃希菌、乳酸桿菌、嗜熱鏈球相鑒別。本文受檢菌菌數(shù)可低至102，與其他文獻(xiàn)根本一致4。16SrRNA熒光定量PR檢測(cè)脆弱類(lèi)桿菌，具有快速、敏感的特點(diǎn)，但在降低費(fèi)用、商品化程度等方面應(yīng)加以改良。參考文獻(xiàn)1蘇維奇，紀(jì)迎春，姜巖.16SrRNA基因檢測(cè)在臨床細(xì)菌學(xué)鑒定中的應(yīng)用J.世界感染雜志，2022，51：79-80，83.2Erjaalinen,AnnaKassinen,TeeuRinttil，etal.parisnfreal-tiePRithSYBRGreenIr5-nuleaseassaysanddt-blthybridizatinithrDNA-targetedlignuletideprbesinquantifiatinfseletedfaealbateriaJ.