基因工程主要技術(shù)與其原理

1、關(guān)于基因工程的主要技術(shù)及其原理第1頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四原理瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶瓊脂糖凝膠電泳第2頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，是由D半乳糖和3、6脫水L半乳糖結(jié)合的鏈狀多糖 第3頁，共149頁，2022年，5月

2、20日，8點15分，星期四豬基因組DNA及PCR產(chǎn)物電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測儀等。 瓊脂糖，1XTAE電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），6X載樣緩沖液 ： 0.25%溴酚藍 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液; 0.25%溴酚藍 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液實驗材料、器具及藥品第4頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四相關(guān)知識： 影響瓊脂糖凝膠DNA遷移速率的因素、遷移速率由DNA的分子大小、瓊脂糖濃度、DNA的構(gòu)象、所加電壓、電場方向、堿基組成與溫度、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成等許多參數(shù)確定。 表 瓊脂糖濃度與DNA

3、分離范圍第5頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四實驗步驟 1g 瓊脂糖加入100ml 1TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60，加入100l的0.5mg/ml EB，并搖勻。） 用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當梳子，將溶解的瓊脂糖（約50）倒入，室溫冷卻凝固 充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。第6頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四(4) 用移液器吸取總DNA或質(zhì)粒樣品4l于點樣板上，再加入上樣緩沖液loading buffer，混勻后，小

4、心加入點樣孔。 打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，電泳約30min-60min。 將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。 將染色后的凝膠置于紫外透射檢測儀上，蓋上防護觀察罩，打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶。實驗步驟第7頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四結(jié)果與分析 圖2 基因組DNA1%瓊脂凝膠電泳圖第8頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四結(jié)果與分析 圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖 (1、2、3、4為PCR產(chǎn)物，M為DL2000Marker) 第9頁，共149頁，2022年，5月20日

5、，8點15分，星期四瓊脂糖凝膠電泳裝置第10頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四實驗步驟制 膠90以上熔化，凝膠溫度35-43 EB第11頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四1231、孔深 2、預留尺寸 3、梳子寬度 1+2= 膠的厚度3第12頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四-+加緩沖液第13頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四拔梳子最好在電泳槽中第14頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四-+點 樣第15頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四-+電 泳紫外第16

6、頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第17頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第18頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第19頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四電泳結(jié)果分析DNA空間結(jié)構(gòu)電壓 EB第20頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四脈沖電場（PFGE） 解決大分子DNA電泳問題 第21頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第22頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四Blotting第23頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，

7、星期四定義：印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNARNA或者DNA-DNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法第24頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四 (1) Southern 印跡雜交法 限

8、制性內(nèi)切酶酶切 檢測雜交信號 提取DNA Southern 法可用于檢測特異的DNA序列片段,進行基因定位、分子量測定等。第25頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四Southern Blot Part I: Gel electrophoresis followed by transfer to a membraneDNA Cleaved with a restriction enzymeSmear of restriction fragments80度烘烤1-2h第26頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四Southern Blot Part II:

9、Hgybridization of DNA on membrane to specific probe第27頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第28頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四DNA stained with ethidium bromideautoradiograph of hybridized membraneSouthern Blot第29頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第30頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第31頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四Northe

10、rn Blot probed with b-globinUndifferentiated cells+ differentiation factorNote: Make northern just like a Southern, except run out RNA samples rather than DNA Measures the steady-state level of mRNA transcript from a given geneSmear of RNA transcripts第32頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四 核酸雜交技術(shù)是目前研究核酸結(jié)構(gòu)、

11、功能常用手段之一，不僅可用來檢驗核酸的缺失、插入，還可用來考察不同生物種類在核酸分子中的共同序列和不同序列以確定它們在進化中的關(guān)系，其主要應(yīng)用如下圖所示 ：第33頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四核酸雜交及其應(yīng)用示意圖.變性、復性和雜交。粗細線分別代表不同DNA。A是雜化雙鏈.突變體的鑒別。B代表天然DNA；C是B的缺失突變體；虛線框內(nèi)是已缺失的部分；D是顯示從天然DNA鏈鼓出小泡 .粗線代表探針，粗線上的X表示放射性標記第34頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四 在核酸雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種用于研究和診斷的非常有用的技術(shù)稱探針技術(shù)(Probe

12、)。 探針技術(shù)在遺傳性疾病診斷上已開始應(yīng)用。 例如診斷地中海貧血或血紅蛋白病，可以由已確診的病人白細胞中提取DNA，這就是診斷探針。用診斷探針檢查，不但可以對有癥狀患者進行確診，還可以發(fā)現(xiàn)一些沒有癥狀的隱性遺傳性疾病。如從胎兒的羊水可以提取到少量DNA后，再用探針技術(shù)對此進行產(chǎn)前診斷各種遺傳性疾病已在臨床上開展。 雜交和探針技術(shù)是許多分子生物學技術(shù)的基礎(chǔ)，在生物學和醫(yī)學的研究中，以及臨床診斷中得到了日益廣泛的應(yīng)用。第35頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四Western blot 實驗技術(shù) 第36頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四Making a

13、probeUse the known amino acid sequence of a proteinSynthesise a short DNA sequence in vitroAA: phe met trp glu cys asnCodons: UUUC AUG UGG GAAG UGUC AAUCProbe: AAAG TAC ACC CTTC ACAG TTAG -P32第37頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四A short sequence of a protein is used to design a set of oligonucleotides fo

14、r use as a probe to recover the gene that encodedthe protein. One of the probe sequence will be a perfect match for thegene 第38頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四Western Blot基本原理 在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。第39頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四Western Blot一般流程蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物

15、顯色第40頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四通過有機溶劑或水溶法制備總蛋白水溶液提取法 針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液 對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑 。 細胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2g/mL Aprotinin, 0.5g/mL Leupeptin ， pH8.0 有機溶劑提取法 對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機溶劑提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。通過層析或電洗脫法制備目的蛋

16、白蛋白樣品的制備第41頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四蛋白樣品的定量Bradford法 考馬斯亮藍G-250有紅、藍兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比 。(上樣量)試劑：考馬斯亮藍工作液，0.1N鹽酸，雙蒸水，蛋白標準液（ 將10mg/ml蛋白溶液稀釋至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。）管號012345678d

17、dH2O807070707070707070蛋白標準液01010101010101010樣品101010101010101010HCL101010101010101010第42頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理： SDS 是一種離子性的界面活性劑,它有強離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當 SDS 與蛋白質(zhì)混合時,它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是 1:1.4 (以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 帶強負價,使蛋白質(zhì)原

18、先的帶電價微不足道,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價一致 (charge density),所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項因素第43頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺 SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過硫酸銨(時間)Tris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份第44頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212第45頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第46頁，共149頁，2022年，5

19、月20日，8點15分，星期四轉(zhuǎn)膜膜的選擇尼龍膜硝酸纖維素膜封閉非特異性抗體結(jié)合麻煩簡單快速封閉非特異性抗體結(jié)合價格昂貴價格便宜特殊要求下的選擇需要更高的蛋白結(jié)合率（尼龍膜： 480g/cm2 ；硝酸纖維素膜：80g/cm2 ）目的蛋白與硝酸纖維膜的結(jié)合能力弱需要更大的機械強度第47頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四轉(zhuǎn)膜半干法將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間，電轉(zhuǎn)1030min。濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)45min或過夜。 第48頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第49頁，共149頁，202

20、2年，5月20日，8點15分，星期四轉(zhuǎn)膜后檢測麗春紅S染色蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。印度墨汁染色只用于放射性標記抗體或放射性標記A蛋白探針的Western印跡過程。 第50頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四封閉脫脂奶粉（5）BSAWestern Blot 膜封閉液（生物試劑公司提供）第51頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四一抗、二抗孵育把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液與濾膜溫育。37一小時，4 過夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10mi

21、n。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動， 37一小時，4 過夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3次，每次10min。第52頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四二抗與底物反應(yīng)顯色辣根過氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學發(fā)光顯色法(HRP)第53頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四Western Blot常見問題分析第54頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入APS和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩

22、塊玻璃板底部要對齊第55頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四條帶比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否合適第56頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四轉(zhuǎn)膜及抗體檢測凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個或多個白點？轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？ 可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長期使用導致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導致?？?/p>

23、在兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙確保膜和膠塊之間沒有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫第57頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四背景太高膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體濃度過高 原原因?qū)Σ咿D(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度第58頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四Western blot is similar in concept to northern, except use pol

24、yacrylamide and run out proteinsSouthern, Northern, and Western analyses第59頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四免疫化學檢測法第60頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四Using antibodies to detect a clone第61頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四重組體的轉(zhuǎn)化利用物理方法導入、轉(zhuǎn)化 1.質(zhì)粒的Ca2+誘導轉(zhuǎn)化 (E. coli ) 2.質(zhì)粒的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 3.質(zhì)粒的高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化 4.顯微注射法轉(zhuǎn)化 第62頁，共149頁，2

25、022年，5月20日，8點15分，星期四利用生物方法導入、轉(zhuǎn)染1.細胞噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染2.動物病毒DNA的轉(zhuǎn)染3.植物病毒DNA的轉(zhuǎn)染第63頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備在不含抗生素的LB平板上涂布大腸桿菌DH5，于37培養(yǎng)過夜(16-20h)；挑一個單菌落接種于25mL無菌的LB 培養(yǎng)液中， 37中速震蕩培養(yǎng)3h；將上述菌液在冰浴5分鐘,然后在 4 ,4000rpm 離心10分鐘;將細菌沉淀用5mL 預冷的CaCl2（0.1M）重懸，冰浴一會后于4 4000rpm離心10分鐘；將細菌沉淀用1mL 預冷的CaCl2（0.1M）重懸，取200

26、uL用于細菌轉(zhuǎn)化,其余菌液加入20%的無菌甘油,搖勻后于-20保存?zhèn)溆? 第64頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化（1）取2L連接產(chǎn)物，加入80L感受態(tài)細胞，混勻，冰上放置30min。（2）將反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)移42水浴中，熱擊90s。（3）將反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)移至冰上2min（4）加入500-800 L LB液體培養(yǎng)基。（5）37，150 rpm復蘇1.5 h。（6）取100L菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上（含100g/mL的Amp）（7）37下培養(yǎng)16-24 h。第65頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四Transforming E.coli

27、with recombinant DNA第66頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四Growth of Bacteria第67頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第68頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR技術(shù)及其應(yīng)用 第69頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四目 錄PCR的概念 PCR技術(shù)的創(chuàng)建PCR的原理PCR的反應(yīng)體系和方法PCR的類型和應(yīng)用第70頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四 多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR：Polymerase Chain Reaction)Polymeras

28、e: DNA聚合酶 第71頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴增第72頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR技術(shù)的創(chuàng)建Kary B. Mullis（穆利斯（美）Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。 1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實現(xiàn)。 1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù) 1989年美國Science雜志列PCR 為十余項重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸

29、年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。第73頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR技術(shù)簡史PCR的最早設(shè)想： 本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。 PCR技術(shù)第74頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR技術(shù)簡史DNA的復制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGG

30、ATCG35解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長PCR技術(shù)第75頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR技術(shù)簡史DNA的復制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技術(shù)第76頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR技術(shù)簡史DNA的復制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCG

31、CTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技術(shù)第77頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR技術(shù)簡史PCR的改進與完善：Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的一個片段，其缺點是：此酶不耐高溫， 90會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。PCR技術(shù)第78頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。 引物鏈延伸

32、反應(yīng)在37下進行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，此種酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴增具備許多突出的優(yōu)點，但由于酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時間內(nèi)沒能引生物醫(yī)學界的足夠重視。PCR技術(shù)PCR技術(shù)簡史第79頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四945537第80頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR技術(shù)簡史1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DN

33、A片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。PCR技術(shù)第81頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四Taq DNA聚合酶的特點：耐高溫，在70下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應(yīng)后再加新酶。大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度(2.0Kb)。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。PCR技術(shù)PCR技術(shù)簡史第82頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶

34、活性(%)溫度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 201988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)第83頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四729455PCR循環(huán)第84頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR技術(shù)的原理1 PCR技術(shù)的基本原理 無細胞分子克隆法：在微量離心管中,加入適量的緩沖液, 微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶, 一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終

35、使基因放大了數(shù)百萬倍; 擴增了特異區(qū)段的DNA帶。 第85頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四加熱變 性復性復溫DNA的變性和復性加熱或強酸、堿性作用可以使 DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱為 DNA的變性。解除變性的條件后, 變性的單鏈可以重新結(jié)合起來,形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復,這稱DNA復性, 也叫退火。 第86頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR反應(yīng)條件PCR過程第87頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR反應(yīng)條件PCR過程第88頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分

36、，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程1234522557294時間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復13步2530輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR技術(shù)第89頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復13步2530輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95PCR技

37、術(shù)復習第90頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點9550引物1引物2DNA引物PCR技術(shù)第91頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR技術(shù)第92頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72第1輪結(jié)束95第2輪開始PCR技術(shù)第93頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的

38、特點955072TaqTaqTaqTaqPCR技術(shù)第94頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72第2輪結(jié)束PCR技術(shù)第95頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點重復30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增PCR技術(shù)第96頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四2 PCR技術(shù)的特點1 ）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加

39、一倍第97頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四2 ）特異性引物引物 引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。 引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。第98頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四引物設(shè)計：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40 bp為宜。（3）堿基盡可能隨機分布,G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補序列。（6）引物3端為關(guān)鍵堿基；5端無嚴格限制。第99頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15

40、分，星期四3）操作簡便易行 PCR擴增法,只需要數(shù)小時,就可以用電泳法檢出1g基因組DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。 通常的DNA 擴增法是分子克隆法, 首先要構(gòu)建含有目的的基因的載體, 然后將它導入細胞后進行擴增,還要用同位索探針進行篩選;這種方法,要經(jīng)過DNA內(nèi)切、連接、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等相關(guān)的過程,操作復雜,一般需要數(shù)周時間。第100頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四目的基因載體復制子宿主細胞擴增擴增提取DNA分子第101頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四4 ）用途廣泛生命學科醫(yī)學工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學考古學第102頁，共149頁，2022年

41、，5月20日，8點15分，星期四PCR的反應(yīng)體系和方法 PCR管加熱使模板變性, 退火使引物與模板DNA互補,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫( 72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復制的起點,合成新鏈。 如此重復改變反應(yīng)溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍; 將擴增產(chǎn)物進行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。第103頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四1 反應(yīng)體系標準的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物 各200u

42、mol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uBuffer （Mg2+ ） 1.5mmol/LPCR技術(shù)第104頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNA dNTP 引物Buffer預變性模板DNA dNTP 引物BufferTaqDNA聚合酶94oC52 基本過程第105頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四PCR技術(shù)的基本過程(2)Taq 酶模板DNA dNTP 引物Buffer循環(huán)儀9455 72 Taq 酶模板DNA dNTP 引物Buffer72 57 min循環(huán)253

43、5次第106頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)第107頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四1）PCR反應(yīng)成分（1）模板 單、雙鏈DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。 一般100ng DNA模板/100L。 模板濃度過高會導致反應(yīng)的非特異性增加。3 PCR反應(yīng)條件第108頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四（2）引物濃度 0.1-0.5 mol/L 濃度過高易導致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquati

44、cus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。第109頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四（4）dNTP dNTP濃度取決于擴增片段的長度 四種dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。第110頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特

45、異性。Mg2+可與負離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。第111頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四2）循環(huán)參數(shù)變性 使雙鏈DNA解鏈為單鏈 94oC 20-30秒(2) 退火 溫度由引物長度和GC含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。第112頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四（3）延伸 70-75,一般為72 延伸時間由擴增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版DNA的濃度 一般為25-35次 次數(shù)過多：擴增效率降低 錯誤摻入率增加第113頁，共149頁，2

46、022年，5月20日，8點15分，星期四經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94 30s 55 45s72 1min94 5min30次72 7min42 forever第114頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四1）不對稱PCR 目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。 方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。 用途：制備核酸序列測定的模板 制備雜交探針 基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究 PCR的類型第115頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四 高濃度引物低濃度引物第116頁，共1

47、49頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。 可對未知序列擴增后進行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列第117頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶第118頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四3）多重PCR（復合PCR）用于檢測特定基因序列的存在或缺失。第119頁

48、，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四電泳引物12341234第120頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四DMD：人類肌營養(yǎng)不良基因A：無外顯子8,12,17,19對應(yīng)條帶,說明病人外顯子819缺失B：病人A中未擴增外顯子帶的強度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者C：正常人DMD基因外顯子的一般擴增形式多重PCR檢測DMD基因缺失第121頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四第122頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四4）LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、熒光素等對引物進行標記,用以直觀

49、地檢測目的基因。 特別適合大量臨床標本的基因診斷 可同時檢測多種基因成分病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4第123頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四標記引物觀察PCR產(chǎn)物第124頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四5）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴增探針親和固相介質(zhì)檢測探針信號可用于基因芯片的制作第125頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四6）逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增第126頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈第127頁，共149頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四7) 熒光定量 PCR（real-time PCR) 通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針,對PCR產(chǎn)物進行標