基因工程常規(guī)技術

1、關于基因工程的常規(guī)技術1第1頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四2第一節(jié) 凝膠電泳技術 什么是電泳技術？ 電泳法，是指帶電荷的供試品（蛋白質、核苷酸等）在惰性支持介質（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，于電場的作用下，向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其百分含量的方法。第2頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四3特點：1.可以制成非常均勻的凝膠，帶電質點在凝膠的孔中泳動。2. 電泳操作方法簡便，電泳速度快3. 分辨率高，重復性好，電泳圖譜清晰。 瓊脂糖 半乳糖及其衍

2、生物構成的中性物質，不帶電荷本節(jié)主要介紹瓊脂糖凝膠電泳技術。瓊脂糖與瓊脂有區(qū)別么？第3頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四4 瓊脂糖鏈依分子內和分子間氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構成大網孔型凝膠。 D-半乳糖3，6-脫水-L-半乳糖第4頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四5第5頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四6瓊脂糖凝膠電泳特點第6頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四7瓊脂糖凝膠的配置1.根據電泳需要，配置合適濃度的電泳及制膠緩沖液。一般為 1 TAE或0.5TBE。注意：用于電泳的

3、緩沖液和用于制膠的緩沖液必須是相同的。2.根據制膠量及凝膠濃度，在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中，加入準確稱量的瓊脂糖粉。 注意：總液體量不宜超過三角錐瓶的50%容量。3. 在微波爐中加熱溶解瓊脂糖注意：必須保證瓊脂糖充分完全溶解，否則，會造成電泳圖像模糊不清。加熱時如膠液劇烈沸騰發(fā)泡，停止加熱。微波爐中加熱時間不宜過長。第7頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四8瓊脂糖凝膠的配置3.使溶液冷卻至60左右，如需要可在此時加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5ug/ml，并充分混勻不提倡使用。注意：溴化乙錠是一種致癌物質。使用含有溴化乙錠的溶液時，請戴用手套。溴化乙錠

4、在可見光下會分解。5. 將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當位置處插上梳子。凝膠厚度一般在35 mm 之間。 注意：不要產生氣泡，溶液溫度太高(60)，會使得水分過分蒸發(fā)，改變凝膠離子濃度，影響電泳效果。6. 在室溫下使膠凝固（大約30 分鐘），然后放置于電泳槽中進行電泳。注意： 凝膠不立即使用時，用保鮮膜將凝膠包好在4下保存，或者放在制膠的緩沖液中，一般可保存25 天。第8頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四9瓊脂糖凝膠緩沖液有幾種緩沖液適用于天然雙鏈DNA的電泳Tris-乙酸鹽和EDTA緩沖液（pH8.0,TAE，也稱為E緩沖液）Tris-硼酸鹽緩沖液(TBE)Tri

5、s-磷酸鹽緩沖液(TPE)第9頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四10瓊脂糖凝膠緩沖液第10頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四11瓊脂糖凝膠緩沖液TBE可以使用10次左右，而TAE用23次就要更換。電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA條帶模糊或不規(guī)則DNA帶遷移。電泳緩沖液剛好沒過凝膠1mm為好，太多則電流加大，凝膠發(fā)熱。第11頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四12瓊脂糖凝膠載樣緩沖液載樣緩沖液是上樣時與樣品一起加入泳道的。載樣緩沖液有三個作用：增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內；使樣

6、品帶有顏色便于上樣操作；其中的染料在電場中以可以預測的泳動速率向陽極遷移。上樣緩沖液有幾種，但基本都包括溴酚藍和二甲苯氰FF。第12頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四13瓊脂糖凝膠載樣緩沖液溴酚藍在瓊脂糖凝膠中遷移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，這一特性與瓊脂糖凝膠的濃度無關；在0.5TBE瓊脂糖凝膠電泳中溴酚藍的速率約與長約300bp的線性雙鏈DNA相同，而二甲苯氰FF約與長4kb的DNA相同。在0.5%-1.4%濃度的瓊脂糖凝膠中基本不會變化。第13頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四14瓊脂糖凝膠載樣緩沖液第14頁，共144頁，2022年，5月

7、20日，8點15分，星期四15影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7第15頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四16影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7DNA分子大小遷移速率U與logN成反比（N為堿基對數目）。分子越大，摩擦阻力越大，同時大分子通過凝膠孔徑的效率也低于較小的分子，所以分子大的遷移慢。等量的空間結構，緊密的電泳快（超螺旋線性DNA）一般來說，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移

8、速度越快。第16頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四17影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7簡言之，濃度越大，分子孔徑就越小，DNA遷移速率就越低，反之遷移速率就大。另外，濃度也跟凝膠的分辨率有關，濃度越大，分辨率越高，但分離的片段就越小。第17頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四18瓊脂糖凝膠的濃度第18頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四19影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌

9、入染料的存在7一般遷移速率超螺旋環(huán)狀線狀DNA單鏈開環(huán)。第19頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四20影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7 低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應超過5-8V/cm第20頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四21影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7 包括標準瓊脂糖和低熔點瓊脂糖以及正在研制的介于二者之間的瓊脂糖。其

10、分辨率等各有不同。第21頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四22瓊脂糖凝膠的濃度第22頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四23影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7溶液pH值距離其等電點愈遠，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大，尤其對于蛋白質等兩性分子，緩沖液pH還會影響到其電泳方向;溶液的離子強度過低，會使電導率降低，DNA不是全然不動就是遷移極慢；而離子過強時，電導率上升，會產生大量熱能，使凝膠變化甚至熔化，也會使DNA變性。第23頁，共144頁，2022年，5

11、月20日，8點15分，星期四24影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7染色劑溴化乙錠插入雙鏈DNA造成其負電荷減少、剛性和長度增加，因此，線性DNA-染料復合物在凝膠中的遷移率約降低15%。第24頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四25DNA分子的遷移速度與其分子質量的對數值成反比關系。 在電場的作用下，帶有負電荷的DNA或RNA核苷酸鏈，依靠無反應活性的穩(wěn)定的介質（瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）和緩沖液，以一定的遷移率從負極移向正極。根據核酸分子大小不同、構型或形狀的差異，可以通過電泳將其混合

12、物中的不同成分彼此分開。 瓊脂糖凝膠電泳基本原理第25頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四26 當用EB對DNA樣品染色時，加入的EB就插入DNA分子中形成熒光結合物，熒光的強度與DNA含量成正比，如果用DNA片段的標準品作電泳對照，就可以估計出待測樣品的分子量大小和濃度。第26頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四27DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測 +-儀器 電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、移液槍；藥品 Agarose、 TAE buffer、EB（溴化乙錠）上樣緩沖液（6X）0.25% 溴酚藍（指示100-200bp的帶）、0.25%二甲苯青（指示800

13、-100bp的帶）、40%蔗糖；水溶液4保存。第27頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四28玻璃片第28頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四29第29頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四30預染色的標本第30頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四31第31頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四32第32頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四33第33頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四34第二節(jié) 分子雜交技術 所依據的原理是，帶有互補的特定核苷酸序

14、列的單鏈DNA或RNA，當它們混合在一起時，其相應的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結構。 核酸雜交技術主要有Southern雜交、Northern雜交和菌落原位雜交等。第34頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四35一、探針與探針標記雜交的主要目的是為了檢測出同源DNA序列，而為了達到這一目的，必需要有標記的探針。帶有能檢測的標記物的DNA或RNA叫探針。使DNA或RNA帶有可檢測的標記物的過程叫探針標記。第35頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四361.切口平移標記用一定濃度的DNaseI在雙鏈DNA的一條鏈的有限位置上打開切口。利用DNA聚合酶I的5

15、3的核酸外切酶活性將DNA一條鏈上的核苷酸一個一個的切除，同時暴露出另一條單鏈DNA。以這條單鏈DNA為模板，利用DNA聚合酶I的5 3的DNA聚合功能把一個一個帶有標記的dNTP合成上去。第36頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四3737 大腸桿菌聚合酶I的應用示例缺口轉移制備探針Pol I + Mg2+32P dNTPs第37頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四382.隨機引物標記能與任何DNA模板的多個位點配對互補的多個不均一序列寡聚核苷酸DNA片段叫隨機引物。DNA聚合酶Klenow大片段能在隨機引物的引導下以帶有標記的dNTP為原料合成新的

16、與模板DNA互補的探針。第38頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四39二、Southern雜交 根據毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當的濾膜上，然后通過同標記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術。由于它是由E.Southern于1975年首先設計出來的，故又叫Southern DNA 印跡轉移技術。 第39頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四40（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片雜交步驟：

17、1.酶切2.電泳(變性）3.轉膜(注意DNA要小于2kb）4.封閉（預雜交）5.雜交6.顯影第40頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四41核酸雜交常用幾種膜的性能比較第41頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四42 Southern DNA 印跡雜交之X光顯像圖片 水稻（Oryza sativa L.)的葉綠體DNA分別用核酸內切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）消化，加樣在含有EB染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現的陽性條帶

18、 ，表明含有水稻的psbA基因序列。第42頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四43三、Northern雜交 1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。由于這種方法與Southern印跡雜交技術十分類似，所以叫做Northern印跡技術（Northern blotting）。 第43頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四44Southern雜交和Northern雜交的主要差別：1.對象不同（DNA/RNA）2.DNA在凝膠電泳分離后，用堿處理變性，形成

19、單鏈。 RNA一般是進行變性電泳，在分離RNA的同時消除二級結構。 RNA變性電泳方法主要有甲醛變性電泳、羧甲基變性電泳和乙二醛變性電泳三種。第44頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四45四、Western雜交 Western blotting是用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，然后將蛋白質從電泳凝膠中轉移到硝酸纖維素膜或其它支持物上，然后同放射性同位素標記的特定蛋白質之抗體進行反應，這種技術廣泛用于基因在蛋白質水平上的表達研究。第45頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四46原理 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯劑N,N-甲叉雙丙烯

20、酰胺(Bis)在加速劑N，N，N，N四甲基乙二胺(簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(簡稱AP)作用下聚合交聯成三維網狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。第46頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四47原理而SDS僅根據蛋白質亞基分子量的不同就可以分開蛋白質。該技術最初由shapiro于1967年建立，他們發(fā)現在樣品介質和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大?。梢院雎噪姾梢蛩兀?第47頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四48十二烷基硫酸鈉（sodium dodec

21、yl sulfate，簡稱SDS）是一種陰離子去污劑，它能破壞蛋白質分子之間以及與其他物質分子之間的非共價鍵，使蛋白質變性而改變原有的空間構象。特別是在強還原劑，如巰基乙醇存在下，由于蛋白質分子內的二硫鍵被還原劑打開，不易再氧化，這就保證了蛋白質分子與SDS充分結合.蛋白質-SDS復合物在水溶液中的形狀，近似于雪茄煙形的長橢圓棒。不同蛋白質的SDS復合物的短軸長度都一樣，約為1.8nm，而長軸則隨蛋白質的分子量成正比變化。這樣的蛋白質-SDS復合物在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質原有電荷和形狀的影響，而只是橢圓棒的長度，也就是蛋白質分子量的函數。帶負電荷的蛋白質-SDS復合物由于結合了大量的SD

22、S，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態(tài)，形成了僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差異。原理第48頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四49實驗原理PAGE根據其有無濃縮效應，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。第49頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四50

23、各部分凝膠配制第50頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四51 實驗過程 1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干, 準備2個干凈的錐形瓶.2.把玻璃板在灌膠支架上固定好.固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板.3.按比例配好分離膠,用移液管快速加入,大約5厘米左右,之后加少許蒸餾水,靜置40分鐘.凝膠配制過程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結無法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免產生氣泡.第51頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四52 實驗過程. 水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡 凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界

24、面.4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入樣梳,靜置40分鐘. 樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平.第52頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四53實驗過程5.拔出樣梳后,在上槽內加入緩沖液,沒過鋸齒時可拆去 底端的瓊脂糖. 要使鋸齒孔內的氣泡全部排出,否則會影響加樣效果.6、加樣三個。 （1）取10l標準蛋白溶解液于EP管內，再加入10l 2倍樣品緩沖液，上樣量為20l。 （2）取10l樣品1溶液，再加入10l 2倍樣品緩沖液，上樣量分別為5l 和10l。7.用微量注射器距槽底三分之一處進樣,加樣前

25、,樣品在 沸水中加熱3分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。 注射器不可過低,以防刺破膠體,也不可過高,在樣下 沉時會發(fā)生擴散. 為避免邊緣效應,最好選用中部的孔注樣.第53頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四54實驗過程8.電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進行電泳，開始電流恒定在10mA，當進入分離膠后改為20mA，溴酚藍距凝膠邊緣約5mm時，停止電泳。 9.凝膠板剝離與染色：電泳結束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標記后放在大培養(yǎng)皿內，加入染色液，染色1小時左右。10.脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數次，再用脫色液脫色，直到蛋白質區(qū)帶清晰。 剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分.11

26、.實驗結果分析。第54頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四55第55頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四56五、菌落原位雜交 也叫原位雜交，是指把菌落或噬菌斑轉移到硝酸纖維素膜上，使溶菌的DNA同濾膜原位結合，帶有DNA的濾膜烘干后，與放射性同位素標記特異的DNA或RNA探針雜交。 是直接菌落或噬菌斑為對象來檢測重組子的技術。第56頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四57檢測重組體克隆的菌落雜交技術第57頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四58第三節(jié)、PCR技術第58頁，共144頁，2022年，5月20日，

27、8點15分，星期四59PCR技術的創(chuàng)建Kary B. Mullis（穆利斯（美）Khorana(1971)等提出在體外經DNA變性,與適當引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設想。 1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術,使Khorana的設想得到實現。 1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術 1989年美國Science雜志列PCR 為十余項重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。第59頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四60一、PCR技術的基本成分 PCR的成分包括：待擴增的模板、

28、引物、DNA聚合酶、四種脫氧核苷酸的混合物以及反應緩沖液。 模板是含有待擴增序列的DNA或從mRNA反轉錄來的cDNA。第60頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四61Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶活性(%)溫度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 201988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術第61頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四62Taq DNA聚合酶Characteristics of Taq Polymerase 第62頁，共144頁，2022年，5月2

29、0日，8點15分，星期四63PCR的引物 是指與待擴增的靶DNA區(qū)段兩端序列互補的人工合成的寡核苷酸片斷。第63頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四64引物的設計原則： 1.引物堿基GC含量以45%55%為宜。 2.其長度通常在1530個核苷酸之間。 3.Tm值應高于55。 引物的另一個重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設定 PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火， 同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55 到70。退火溫度一般設定比引物的 Tm低5。 2

30、個引物要有近似的Tm值，以免相差太大，引起非特異性擴增；一般退火溫度為最高Tm值的引物溫度減5.第64頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四654.PCR擴增的長度一般：GCA。即當引物3末端為A時，即使有錯配堿基也最不易延伸，所以引物設計時可將3末端設計為A，以提高復制精確性。另一種理論是3末端應設計為G或C，因為G和C的氫鍵多于A與T，能更好地與模板結合開始DNA合成，當然對錯配延伸效率方面就不能苛求了?？偠灾锏?末端不要考慮使用T。 6.盡量減少自身配對。 7.避免兩條引物互補。 8.引物要特異。 9.可以在引物的5端加上合適的酶切位點。一般引物自身配對形成莖

31、環(huán)結構，莖的堿基對數不大于3，兩條引物間配對堿基數小于5個。第65頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四66引物的設計可以參照： 兩分鐘StepByStep學會引物設計軟件 Primer premier5.0/oligo軟件 核酸基因技術討論版/生物信息學討論版/ PCR技術討論版/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi引物設計網址：第66頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四67反應條件1PCR緩沖液 常用的1PCR緩沖液為10mmolL Tris-HCl pH8.3(常溫)，50mmolL KCl，1.5mmolL MgCl2。

32、由試劑公司與Taq酶一起提供。 (1)Mg2+離子濃度：Mg2+離子濃度對PCR反應影響很大，因為Mg2+與引物-模板及產物的解鏈溫度、產物的特異性、引物二聚體的生成、產物的忠實性、酶活力、產物的產量等諸多因素有關。Mg2+一般使用濃度為0.52.5mmolL，必要時可以0.5mmolL梯度間隔做Mg2+最適濃度試驗。第67頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四68(2)dNTP：常用dNTP濃度為20molL(可用范圍為20200molL)。dNTP的用量與PCR產量及產物忠實性有關，dNTP量過少時合成的產物減少。(3)K+離子濃度：PCR反應中K+離子的作用是促進Ta

33、q酶活力與促進引物退火，一般使用濃度是50mmolL，但當K+離子濃度高于50mmolL時會抑制Taq酶活力。第68頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四692模板 PCR模板可以是DNA或RNA，RNA需反轉錄后再擴增。模板可以是基因組DNA或純化的質粒DNA，當然兩者的DNA量在PCR起始模板中相差很大。每個PCR反應中加入的模板數量可在102105分子之間，必要時可低至50個分子，模板的量少時應酌情增加循環(huán)次數。小于100ng的哺乳動物細胞基因組DNA(相當于約104個細胞)，經30個循環(huán)，10的反應物應能夠在溴化乙錠染色的凝膠上看到一條主要產物帶。使用較大量的模板時

34、，循環(huán)數可減少；如果模板量很少，可能需要增加至45個循環(huán)反應。第69頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四703引物濃度 常用引物濃度為0.10.5molL。隨著引物濃度的降低，PCR反應的特異性提高但產物得率降低；隨著引物濃度的升高，情況正好相反。第70頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四71二、PCR技術的原理和過程 947260？主要是為了保險起見，使模板DNA的二級結構充分打開。有些化學修飾的熱啟動酶這一步時間還要長，目的是充分釋放酶活 第71頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四72溫度（）時間（min）94726094變

35、性（1min）60 退火（1min）72 延伸（1.5min）循環(huán)1 循環(huán)2 循環(huán)3PCR反應的溫度循環(huán)周期 PCR 反應的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應延伸三個步驟完成的。圖中設定的反應參數是94變性1min， 60 退火1min， 72 延伸1.5min。如此周而復始，重復進行，直至擴增產物的數量滿足實驗需求為止。第72頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四73第73頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四74PCR 擴增過程中片段增殖的計算第74頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四75PCR反應體系的確立Wa

36、terBuffer（10）Mg+（25mM）dNTPs（10mM）Primer1（10uM）Primer2（10uM）Taq（5U/uL）Templets12.821.60.4110.2120uL反應體系中各成分的母液濃度及加入量PCR擴增程序舉例Tem.9494607272Time00:08:0000:00:3000:00:4000:01:0000:07:00Cycles30第75頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四76經典循環(huán)參數（500bp以內）94 30s 55 45s72 1min94 5min30次72 5min42 forever第76頁，共144頁，202

37、2年，5月20日，8點15分，星期四77PCR擴增結果分析舉例 M 1 2 3 4 5 6 7 MM, marker;1-2, PCR for CP4-EPSPS gene; 3-4, PCR for 35S Promoter; 5-6, PCR for lectin gene; 7, Negtive control.第77頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四78PCR常見問題 無擴增產物 非特異性擴增 拖尾 假陽性第78頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四79PCR常見問題之一無擴增產物模板:含有抑制物，含量低Buffer對樣品不合適引物設計不當或

38、者發(fā)生降解反應條件：退火溫度太高，延伸時間太短 原因對策純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量更換Buffer或調整濃度重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內二級結構）或者換一管新引物降低退火溫度、延長延伸時間現象：正對照有條帶，而樣品則無；第79頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四80PCR常見問題之二 非特異性擴增 現象：PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。第80頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四81PCR常見問題之二引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫

39、度偏低循環(huán)次數過多 原因對策重新設計引物或者使用巢式PCR適當降低模板或引物濃度適當減少酶量降低鎂離子濃度適當提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數 非特異性擴增第81頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四82PCR常見問題之三 拖尾 現象：產物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。 M 1 2第82頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四83PCR常見問題之三模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數過多 原因對策純化模板更換Buffer適當提高退火溫度適量用酶適當降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數 拖尾第83頁，共14

40、4頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四84PCR常見問題之四 假陽性（篩選轉基因、檢測基因表達情況) 原因：靶序列或擴增產物的交叉污染 現象：空白對照出現目的擴增產物 對策：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用。各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。 第84頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四85三、熒光定量PCR是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應過程結合相應軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品的初始模板量

41、。熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀，通常配有電腦系統(tǒng)及相應的軟件。標記方法主要有：內插染料 、雙標記探針、分子信標等。第85頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四86SYBR GREEN I1、SYBR Green 法第86頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四87第87頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四88SYBR Green 熔解曲線分析第88頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四892、TaqMan探針法第89頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四90Ta

42、qMan作用機理第90頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四91Molecular beacon？第91頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四92熒光定量PCR的優(yōu)點1.全封閉的PCR過程，無需跑膠。2.采用dUTPUNG酶防污染，有效降低污染機會。原理：UNG酶的作用原理是選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈或單鏈DNA中的尿嘧啶糖苷鍵，形成的有缺失堿基的DNA鏈，在堿性介質以及高溫下會進一步水解斷裂，從而被消除.UNG酶的最佳活性溫度為50，95滅活。 作用：為保證PCR結果的準確性，要預防非特異性PCR擴增和污染。常用的措施是使用UNG酶(Uracil-N

43、-Glycosylase)和Taq酶熱啟動。PCR反應最常見, 最重要的污染物是PCR產物,防污染熱啟動PCR試劑盒以dUTP取代dTTP，所以PCR產物都是含有dU的DNA鏈。在PCR開始前增加50的保溫步驟，UNG酶即可將反應體系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶堿基降解，并在隨后變性這步的條件下DNA鏈斷裂,消除由于污染DNA產生的擴增，從而保證擴增結果的特異性，準確性。同時UNG酶被滅活,不會再降解新擴增的產物U-DNA。 第92頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四933.對樣品擴增的整個過程進行實時監(jiān)控。4.使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合，提高了PCR反

44、應的特異性。5.在樣品擴增反應的最佳階段進行數據采集，增加了定量的精確性。6.線性關系直接。7.結果分析更加快捷方便。熒光定量PCR的優(yōu)點第93頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四94第四節(jié)、生物芯片 美國財富雜志載文指出，在20世紀科技史上有兩件事影響深遠，一是微電子芯片，它是計算機和許多家電的心臟，它改變了我們的經濟和文化生活，并已進入每一個家庭；另一件事就是生物芯片，它將改變生命科學的研究方式，革新醫(yī)學診斷和治療，極大地提高人口素質和健康水平。第94頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四95第四節(jié)、生物芯片生物芯片就是在一塊指甲大小的玻片、硅片、

45、尼龍膜等材料上放上生物樣品，然后由一種儀器收集信號，用計算機分析數據結果。目前制備芯片的固相材料有玻片、硅片、金屬片、尼龍膜等。 生物芯片主要分為基因芯片和蛋白芯片。第95頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四96一、基因芯片基因芯片技術是指將大量寡核苷酸或DNA探針（與核酸分子雜交相反，亦稱靶基因）按特定的排列方式固化在固相支持物表面，按堿基互補配對的原則，與標記的特異的單鏈DNA或RNA（待測樣品）分子雜交形成雙鏈，通過對雜交信號的檢測分析，即可得出樣品分子的數量和序列信息。由于基因芯片上固定的探針可以是cDNA、寡核苷酸或來自基因組的基因片段，且這些探針固化于芯片上形

46、成基因探針陣列，故基因芯片又被稱為DNA芯片、DNA陣列、cDNA芯片、寡核苷酸陣列等 。第96頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四97DNA芯片技術工作流程主要包括：芯片的制備、樣品的準備與標記、雜交、信號檢測和數據分析處理，其中最關鍵的是芯片的制備。DNA芯片基本應用可分為兩個主要方面：定量分析（主要指測序和突變檢測）與定性分析（主要指對基因表達的研究）。 如： 1.DNA序列測定 2.突變及多肽性分析 3.基因表達分析 4.基因組研究 5.基因診斷 6.藥物研究與開發(fā)第97頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四98基因芯片雜交檢測流程圖第98頁，

47、共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四99二、蛋白芯片 蛋白芯片是以蛋白質代替DNA作為檢測對象。 其原理是將各種蛋白質有序的固定于某種介質的載體上成為檢測的芯片，然后用標記了有特定熒光物質的抗體與芯片作用，與芯片上的蛋白質相匹配的抗體將與其對應的蛋白質結合，在將未與芯片上的蛋白質互補的抗體洗去之后利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術，檢測芯片上各點的熒光強度，在通過計算機分析蛋白質之間的相互關系以及基因表達功能等。第99頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四100基因文庫的基本概念 從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構建）。根據構

48、建方法的不同，基因文庫分為： 基因組文庫（含有全部基因） cDNA文庫（含有全部蛋白質編碼的結構基因） 第五節(jié)、基因文庫構建第100頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四101一、基因組文庫基本步驟: 1.分離基因組 DNA 2.DNA 的斷裂 物理剪切 (包括吹吸、振蕩和超聲波）和限制性酶解 3.DNA 片斷的分離與連接 4.包裝，轉染或者轉化第101頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四102二、cDNA 文庫的構建基本步驟： 1) mRNA 分離、純化和分級分離 2) cDNA的合成 3) 與載體的連接 4) 轉化第102頁，共144頁，2022年

49、，5月20日，8點15分，星期四103RNA提取流程 樣品前處理注意點 選擇新鮮血液，不得超過4小時選擇新鮮的幼嫩組織選擇處于生長旺盛的時期收集細胞選擇新鮮組織，生長旺盛的組織第103頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四104可將新鮮血液先進行紅細胞裂解，得到的白細胞然后加入一定量的TRNzol，-70保存較長時間去掉培養(yǎng)基，加入一定量TRNzol-70 保存較長時間推薦使用專門的RNA樣品儲存液進行儲存液氮或加入RNase抑制劑中保存，避免反復凍融RNA提取流程 樣品前處理中如何保存樣本第104頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四105所有RNA的

50、提取過程中都有五個關鍵點，即樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復合體變性；對內源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質的有效除去。但其中最關鍵的是抑制RNA酶活性第105頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四106 模板mRNA 的質量直接影響到cDNA 合成的效率。在提取過程中要嚴格防止RNA 酶的污染,并設法抑制其活性,這是本實驗成敗的關鍵。所有的組織中均存在RNA 酶,人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實驗過程中均需戴手套操作并經常更換（使用一次性手套）。第106頁，共144頁，2022

51、年，5月20日，8點15分，星期四107所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200烘烤2 小時以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理。DEPC 是RNA 酶的化學修飾劑,它和RNA 酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應而抑制酶活性。DEPC 水溶液會致癌,因而使用時需小心。 第107頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四108RNA提取的通用方法 RNA提取的一般步驟 RNA提取的一般步驟是：破碎組織分離RNA沉淀RNA洗滌RNA融解RNA保存RNA .第108頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四109破碎組織

52、和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、SDS、蛋白酶K等破碎組織加入-ME可以抑制RNA酶活性。 分離RNA一半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開。 沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或異丙醇。 洗滌RNA使用70乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。 RNA提取的通用方法第109頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四110二、cDNA克隆片段的獲得 cDNA第一鏈的合成 第二鏈的合成雙鏈DNA末端的處理第110頁，

53、共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四111mRNA1. cDNA第一鏈的合成 5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH35ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH3TTTTTTTTTTTTTTp 55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第一鏈引物退火逆轉錄酶dNTPs第111頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四1122. cDNA第二鏈的合成 煮沸NaOH自身引導法：獲得的雙鏈cDNA 5端會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAO

54、H 3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1第112頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四1133)第二鏈cDNA的合成 氫氧化鈉消化雜合雙鏈中的 mRNA 鏈 第一鏈 cDNA 的 3-末端就會形成一個發(fā)夾環(huán) 合成第二鏈cDNA S1 核酸酶消化連接處 自身引導法合成cDNA第二鏈第113頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四114DNApol dNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈cD

55、NA 5端也會有幾對堿基 缺失5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAp 55S1 AAAATTTOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55TTTTTTTTTTTTTTOH 3AAAAAAAAAAAAAA 55TTTTTTTTTTTTTT 33T4-DNA ligase第114頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四115第115頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四116常用方法第116頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四117CH3CH3CH3CH3CH

56、3CH3接頭加接頭第117頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四1183. 雙鏈DNA末端的處理雙鏈平頭的cDNA通常可以使用下列三種方法克隆入載體中： 平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收 平頭兩端分別接同聚物尾和酶切位點，便于片段回收加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收 第118頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四119基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較第119頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四120感受態(tài)細胞的制備及質粒DNA的轉化Ca2+誘導的完整細胞的轉化適用于革蘭氏陰性細菌（如大腸桿菌等），1970年建

57、立此技術，其原理是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結構，后者經熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現空隙，細菌細胞此時的狀態(tài)叫做感受態(tài) 基本方法：細菌經0 的低滲CaCl2處理，使細菌處于感受態(tài)，然后加入甘油-70條件下保存第120頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四121感受態(tài)制備成功的驗證 分別取2個200l感受態(tài)細胞懸液 第一組轉化實驗組： 0.5l(50ng)pUC18/pUC19 + 200l感受態(tài)細胞 第二組受體菌對照組： 0.5l無菌水 + 200l感受態(tài)細胞懸液第121頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四122實驗結果含抗生素LB平板

58、培養(yǎng)基 第一組有菌落，第二組無菌落 第一組、第二組均無或有菌落 普通LB平板培養(yǎng)基 第一組、第二組均無菌落 第一組、第二組均有菌落 成功失敗失敗成功第122頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四123第123頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四124轉化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。第124頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四125 感受態(tài)細胞新鮮配制的或從-80凍存取出后置于冰水中融化。 取出分裝到Epp

59、endorf管中，每管100200uL。 加入需轉化的DNA溶液25ul充分混勻(15ug/mLDNA)。 冰水中放置30分鐘。 37或42水浴2分鐘。(熱休克) 冰浴2min。 每管再加入1mL LB培養(yǎng)基，37振蕩培養(yǎng)1小時。 取出后稍加離心，去掉部分上清，留500uL或250mLLB則全部鋪板。（2） 轉化步驟第125頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四126第六節(jié)、酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交技術作為發(fā)現和研究在活細胞體內的蛋白質與蛋白質之間的相互作用的技術平臺，在近幾年來得到了廣泛運用。 酵母雙雜交技術既可以用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質之間的互作，也可以用來研

60、究高等植物基因組編碼的蛋白質之間的互作。因此，它在許多的研究領域中有著廣泛的應用。 第126頁，共144頁，2022年，5月20日，8點15分，星期四127 酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調控轉錄起始過程的認識。細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與。反式轉錄激活因子，例如酵母轉錄因子GAL4在結構上是組件式的（modular），往往由兩個或兩個以上結構上可以分開，功能上相互獨立的結構域（domain）構成，其中有DNA結合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和轉錄激活結構域（activation domain，DNA-AD）。這兩個結構域將它們分開時仍分別