病毒檢測課件

1、病毒抗體（抗原）檢測匯報(bào)人：閆璐酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）膠體金免疫層析技術(shù)（GICA）梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)(TPPA)ELISA基本原理使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。樣品和酶結(jié)合物與固相載體上抗原或抗體反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，洗滌去除未結(jié)合物，加入底物，根據(jù)底物顯色程度來判定免疫反應(yīng)是否存在及待測物質(zhì)含量。包被、封閉聚苯乙烯聚氯乙烯硝酸纖維素膜玻璃纖維素膜尼龍膜塑料制品微粒膜載體固相載體合微球或顆粒高分子單體聚包被：將抗原或抗體結(jié)合在固相載體上的過程稱為包被。封閉：用1

2、%5%的牛血清白蛋白或5%20%小牛血清再包被一次，消除由于加入血清和酶結(jié)合物中蛋白質(zhì)部分吸附于固相載體表面產(chǎn)生非特異性顯色的干擾，此過程稱為封閉。ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高；催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高；專一性強(qiáng)；性質(zhì)穩(wěn)定；來源豐富；價(jià)格低廉；制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留活性和催化能力；在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶；相應(yīng)底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測定。乙酰膽堿酯酶辣根過氧化物酶HRP堿性磷酸酶AP-D-半乳糖苷酶葡萄糖氧化酶ELISA常用酶酶結(jié)合物組成成分酶 辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶?？乖涂贵w 抗體：特異性好、效價(jià)高、親和力強(qiáng)、比活性高、能批量生產(chǎn)、易于分離純化。常用純度較高

3、的IgG。 抗原：模式不多，要求純度高，抗原性完整。酶結(jié)合物的制備戊二醛交聯(lián)法： ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。 一步法：戊二醛直接加入酶與抗體的混合物 1.酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊 二 醛，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。 兩步法： 2.抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。過碘酸鹽氧化法：用于含糖量較高的酶。HRP的標(biāo)記常用 此法。方法：過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基，與蛋白 質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。方法底物選擇未被酶催化以前應(yīng)該是無色的，而經(jīng)酶催化后有明顯的顏色變化；所顯色易于洗脫；顯色后的產(chǎn)物要求穩(wěn)定；價(jià)廉，易得而且無毒。ELISA溫育常用溫度 43、37、

4、室溫、4。37是實(shí)驗(yàn)室常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的適宜溫度。抗原抗體反應(yīng)在37下經(jīng)過1-2h，產(chǎn)物生成可達(dá)頂峰。有些試驗(yàn)43可加速反應(yīng)，但不宜采用更高溫度。4抗原抗體反應(yīng)更為徹底，但所需時(shí)間長，一般不采用。ELISA常用方法（一）測抗原1.競爭法:小分子半抗原（藥物、激素等）3.抑制性測定法（二）測抗體1.間接法：HCV、HIV、TP2.雙抗原夾心法：HBsAb3.競爭法:HBcAb、HBeAb4.捕獲法（反向間接法）：HAV-IgM、HBc-IgMELISA影響因素固相載體抗原試驗(yàn)樣品酶結(jié)合物洗滌劑與稀釋劑底物作用時(shí)間結(jié)果判斷試驗(yàn)的重復(fù)性醫(yī)大二院學(xué)習(xí)報(bào)告報(bào)告復(fù)檢檢測加樣準(zhǔn)備 樣品

5、接收 樣品編號 掃碼 離心HAV、HBV、HCV、HEV、HIV：手動(dòng)酶免法檢測HIV： 膠體金法TP：TPPA檢測由一個(gè)基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負(fù)離子（AuCl2-），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。膠體金結(jié)構(gòu)膠體金性質(zhì)染色不同粒徑，不同顏色 25nm：橙色、1020nm：酒紅色、3080nm：紫紅色膠體的特性充分的溶解性，良好的流動(dòng)性吸附能力在不改變蛋白性質(zhì)的情況下，穩(wěn)定迅速的吸附蛋白膠體金免疫層析技術(shù) 以膠體金為顯色媒介，利用免疫學(xué)中抗原抗體能夠特異性結(jié)合原理，在層析過程中完成這一反應(yīng)，從而達(dá)到檢測的目

6、的。膠體金免疫層析技術(shù)特點(diǎn)快速，定性：10min中以內(nèi)就可以得到檢測結(jié)果。無需設(shè)備：一根檢測條就能完成檢測。準(zhǔn)確，靈敏：靈敏度可達(dá)到10-9數(shù)量級膠體金免疫層析試紙條的構(gòu)成GICA反應(yīng)模式A 雙抗體夾心法測抗原B.競爭法測抗原C.間接法測抗體（反流免疫層析法）膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)用梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)(TPPA)梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)（TPHA） 原理：用超聲裂解的梅毒螺旋體為抗原，致敏經(jīng)醛化、鞣化的羊或禽類紅細(xì)胞，此致敏紅細(xì)胞與人血清或血漿中的梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可觀察的凝集反應(yīng)。梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)(TPPA) 原理：與TPHA基本相同，以人工合成的惰性明膠顆粒代替TPHA試驗(yàn)的紅細(xì)胞作為載體，是TPHA的