機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、范姝琳范姝琳謝佳男范姝琳謝佳男趙莉佩趙莉佩田佳怡指導(dǎo)教師：紀(jì)影實(shí)指導(dǎo)教師：紀(jì)影實(shí)Medicine 氫化可的松通過抑制氧化應(yīng)激而發(fā)揮腦缺血保護(hù)作用的研究。研究背景腦缺血 現(xiàn)在，臨床上已研發(fā)出多種對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用的藥物，目的是消除缺血期間生化紊亂、防止缺血再灌注損傷、為溶栓治療爭(zhēng)取更多的時(shí)間。 腦缺血是大腦血液供應(yīng)不足時(shí)出現(xiàn)的一種癥狀。腦缺血時(shí)，可引起大腦的一系列生理變化，如：線粒體能量代謝障礙、神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)、鈣超載和酸堿平衡紊亂等。這些生理變化都將使腦受到嚴(yán)重的損傷，而引起神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。研究背景腦缺血損傷機(jī)制 現(xiàn)在，臨床上已研發(fā)出多種對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用的藥物，目的是消除缺血期間生化紊亂

2、、防止缺血再灌注損傷、為溶栓治療爭(zhēng)取更多的時(shí)間。 腦缺血是大腦血液供應(yīng)不足時(shí)出現(xiàn)的一種癥狀。腦缺血時(shí)，可引起大腦的一系列生理變化，如：線粒體能量代謝障礙、神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)、鈣超載和酸堿平衡紊亂等。這些生理變化都將使腦受到嚴(yán)重的損傷，而引起神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。 腦缺血損傷的機(jī)制十分復(fù)雜，有多種因素參與，諸如鈣超載、興奮性氨基酸毒性作用、氧自由基的毒性作用等。隨著對(duì)自由基研究的深入，人們逐漸證實(shí)自由基連鎖反應(yīng)是腦缺血的核心病理環(huán)節(jié)。自由基: 外層軌道具有不配對(duì)電子的院子、原子團(tuán)、例子和分子統(tǒng)稱為自由基。自由基通常性質(zhì)比較活躍，能與多種生物分子反應(yīng)從而改變這些大分子的理化性質(zhì)。人體內(nèi)的自由基主要有超氧陰離

3、子（O2）、羥自由基（OH）、烷自由基、一氧化氮自由基等。腦缺血腦缺血 一氧化氮自由基的來源 一氧化氮合酶途徑（NOS） NOS廣泛存在于各種類型的細(xì)胞中，它可以催化L-精氨酸和分子氧化反應(yīng)生成一氧化氮自由基（NO）?，F(xiàn)已確定NOS亞型有3種，根據(jù)原形酶的組織來源不同分別成為內(nèi)皮細(xì)胞型NOS（eNOS）、腦神經(jīng)元型NOS（nNOS）和誘導(dǎo)型NOS（iNOS），其中iNOS在缺血、缺氧、細(xì)胞損傷和炎性反應(yīng)的激活下表達(dá)增強(qiáng)，產(chǎn)生釋放大量的NO。NO能與O2反應(yīng)生成過氧亞硝酸鹽（ONOO），后者不穩(wěn)定，質(zhì)子化生成過氧亞硝酸鹽（ONOOH），再分解生成OH和NO2，具有神經(jīng)毒性。氫化可的松 氫化可的松

4、，作為一線抗炎藥，近年來被發(fā)現(xiàn)對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用。有國(guó)外研究顯示，糖皮質(zhì)激素可抑制細(xì)胞內(nèi)iNOS mRNA表達(dá)，從而減少NO的釋放。國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展 探究氫化可的松是否通過抑制細(xì)胞內(nèi)iNOS mRNA表達(dá)、減少NO的釋放，而發(fā)揮對(duì)腦缺血的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?探究氫化可的松是否通過抑制細(xì)胞內(nèi)iNOS mRNA表達(dá)、減少NO的釋放，而發(fā)揮對(duì)腦缺血的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊饬x 探究氫化可的松治療腦缺血的機(jī)制，為研究新藥提供新思路。意義 探究氫化可的松治療腦缺血的機(jī)制，為研究新藥提供新思路。創(chuàng)新點(diǎn) 氫化可的松發(fā)揮腦缺血保護(hù)作用的新機(jī)制！實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1 藥品與試劑 氫化可的

5、松、MDA試劑盒、Griess試劑盒 1.2 主要儀器設(shè)備 分光光度計(jì)、組織勻漿器、2ml EP管、37度孵箱1.3 動(dòng)物及分組 健康雄性成年小鼠20只，體重2832g分為3組：假手術(shù)組；缺血組；給藥組， 1. 實(shí)驗(yàn)材料1.1 藥品與試劑 氫化可的松、MDA試劑盒、Griess試劑盒 1.2 主要儀器設(shè)備 分光光度計(jì)、組織勻漿器、2ml EP管、37度孵箱1.3 動(dòng)物及分組 健康雄性成年小鼠20只，體重2832g分為3組：假手術(shù)組；缺血組；給藥組， 1. 實(shí)驗(yàn)材料2.1 模型制備 將小鼠乙醚吸入全身麻醉后仰背位固定于手術(shù)板上，頸前去除被毛、消毒，皮膚正中開口，鈍性剝離頸總動(dòng)脈以及迷走神經(jīng)，每側(cè)

6、備線2根，分別結(jié)扎，當(dāng)?shù)谌€結(jié)扎完時(shí)開始計(jì)時(shí)，然后在兩根線中間將頸總動(dòng)脈剪斷，縫合切口，假手術(shù)組只剝離頸總動(dòng)脈不接扎。手術(shù)結(jié)束后迅速松開小鼠。2. 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1 模型制備 將小鼠乙醚吸入全身麻醉后仰背位固定于手術(shù)板上，頸前去除被毛、消毒，皮膚正中開口，鈍性剝離頸總動(dòng)脈以及迷走神經(jīng)，每側(cè)備線2根，分別結(jié)扎，當(dāng)?shù)谌€結(jié)扎完時(shí)開始計(jì)時(shí)，然后在兩根線中間將頸總動(dòng)脈剪斷，縫合切口，假手術(shù)組只剝離頸總動(dòng)脈不接扎。手術(shù)結(jié)束后迅速松開小鼠。2.2 存活時(shí)間、存活率的測(cè)定 模型制作完成后，立即開始記時(shí)，記錄6h內(nèi)死亡的動(dòng)物數(shù)，計(jì)算存活率，記錄死亡動(dòng)物的存活時(shí)間。2. 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)材料與方法2

7、.2 存活時(shí)間、存活率的測(cè)定 模型制作完成后，立即開始記時(shí)，記錄6 h內(nèi)死亡的動(dòng)物數(shù)，計(jì)算存活率，記錄死亡動(dòng)物的存活時(shí)間。2.3 大腦內(nèi)NO和丙二醛MDA含量測(cè)定 用Griess試劑盒測(cè)定小鼠大腦內(nèi)NO濃度，用MDA試劑盒測(cè)定腦內(nèi)丙二醛濃度。2. 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)材料與方法2.3 大腦內(nèi)NO和丙二醛MDA含量測(cè)定 用Griess試劑盒測(cè)定小鼠大腦內(nèi)NO濃度，用MDA試劑盒測(cè)定腦內(nèi)丙二醛濃度。2.4 統(tǒng)計(jì)分析 存活時(shí)間和MDA含量數(shù)據(jù)以xSEM 表示，應(yīng)用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，通過單因素方差分析Homogeneity of variance test判斷方差是否齊性，方差齊性采用LSD 檢驗(yàn)

8、，方差非齊性采用Dunnetts T3檢驗(yàn)，比較各組間的顯著性差異，P0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。存活率通過2-test 比較各組間顯著性差異，P0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2. 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)材料與方法預(yù)期結(jié)果1.模型組NO濃度、MDA含量均高于假手術(shù)組，生存時(shí)間低于假手術(shù)組；2.給藥組NO濃度、MDA含量均低于模型組，且生存時(shí)間長(zhǎng)于模型組；此預(yù)期結(jié)果可證實(shí)：氫化可的松預(yù)處理成年小鼠，可減少NO的合成，減少腦組織自由基，降低氧化應(yīng)激損傷，從而對(duì)腦缺血起到保護(hù)作用。研究中可能出現(xiàn)的情況、問題及解決辦法問題1：雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉后，小鼠存活時(shí)間較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)程進(jìn)行較慢。解決方法：進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，提高操作熟練程度，

9、減少手術(shù)時(shí)間。問題2：在實(shí)驗(yàn)中，如何降低組織NO濃度的損失。解決方法：小鼠死亡后，迅速將腦組織取出，放入冰盒中，迅速勻漿測(cè)定，防止NO損失。問題3：理想判斷死亡的指標(biāo)是腦電的停止，但條件不能滿足。解決方法：用呼吸和心率來間接作為測(cè)量指標(biāo)。問題4：腦組織勻漿稀釋后體積較大，由于實(shí)驗(yàn)條件所限無(wú)法盛裝。解決方法：選取夾閉頸總動(dòng)脈影響較大的組織海馬來做以測(cè)量。深入探求糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)iNOS的機(jī)制；展望探求糖皮質(zhì)激素對(duì)海馬起到保護(hù)作用后，對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響；探求不影響糖皮質(zhì)激素抑制NO的途徑并能對(duì)糖皮質(zhì)激素的副作用有遏制作用的藥物，從而為聯(lián)合用藥提供新的思路。1 Dexamethasone pre-tre

10、atment protects brain against hypoxic-ischemic injury partially through up-regulation of vascular endothelial growth factor A in neonatal rats Y. Feng, P.G. Rhodes, A.J. Bhatt Neuroscience Volume 179, 14 April 2011, Pages 223232.2 Amino Acids. 2011 Oct 14. Post-transcriptional divergence in the regu

11、lation of CAT-2A, CAT-2B and iNOS expression by dexamethasone in vascular smooth muscle cells.Thakur S, Baydoun AR.3 BMC Neurosci. 2011 May 26;12:49.Dexamethasone inhibits the Nox-dependent ROS production via suppression of MKP-1-dependent MAPK pathways in activated microglia.Huo Y, Rangarajan P, Li

12、ng EA, Dheen ST.4 Shock. 2010 Jan;33(1):64-9.Dexamethasone inhibits the induction of iNOS gene expression through destabilization of its mRNA in proinflammatory cytokine-stimulated hepatocytes.Ozaki T, Habara K, Matsui K, Kaibori M, Kwon AH, Ito S, Nishizawa M, Okumura T.5 周偉,吳圣楣,陳惠金.地塞米松對(duì)缺氧缺血新生大鼠腦內(nèi)

13、誘生型一氧化氮合酶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)J.中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2000，3(2)：123-126.6 王曉娟,余華峰.自由基與腦缺血再灌注損傷.國(guó)外醫(yī)學(xué)老年醫(yī)學(xué)分冊(cè),2011,22(1)：17-19.7 王寶宏,馬蓮美,孫允宵,王建勇.地塞米松預(yù)處理對(duì)新生鼠缺氧缺血腦損傷的保護(hù)作用J.中國(guó)兒童保健雜志,2008,16(2):185-187.8 余兵,何權(quán)瀛,等.糖皮質(zhì)激素及茶堿對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥與肺內(nèi)一氧化氮抑制作用的研究J.中華結(jié)核和呼吸雜志,1998,21(11):664-667.9 Barnes PJ.糖皮質(zhì)激素抗炎作用:分子機(jī)制英.國(guó)外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊(cè),1993,14:436.10Lucyna Mastalerz, Hanna Kasperkiewicz.Effect of inhaled corticosteroids on small airway inflammation in patients with bronchial asthma.Polskie Archiwum Medycyny Wewnetrznej.2011; 121 (7-8):264-268.11 張予陽(yáng)，潘賀，王秋菊,等.小鼠頸總動(dòng)脈結(jié)扎合并低血壓模型的建立及驗(yàn)證.2010年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第十屆中國(guó)藥師周論文集.201112