江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練計劃立項申請表

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔傾情為你奉上專心專注專業(yè)專心專注專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔傾情為你奉上專心專注專業(yè)江 蘇 省 高 等 學(xué) 校大學(xué)生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練計劃立項申請表申請單位： 南京醫(yī)科大學(xué) 新藥exendin-4對糖尿病并發(fā)癥新藥exendin-4對糖尿病并發(fā)癥缺血性腦損傷的治療作用研究項目名稱： 主 持 人： 柳超、孫賢 指導(dǎo)老師： 郭 軍 二九年五月江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目申請表項目名稱新藥exendin-4對糖尿病并發(fā)癥缺血性腦損傷的治療作用研究項目所屬一級專業(yè)門醫(yī)學(xué)項目所屬二級專業(yè)類基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)項目實施時間起始時間： 2009 年 6 月 完成時間： 2011 年 6 月

2、項目類型（）個人 （）團(tuán)體申請人或申請團(tuán)隊姓名年級學(xué)校所在院系、專業(yè)聯(lián)系電話E-mail主持人柳超06南京醫(yī)科大學(xué)七年制臨床醫(yī)學(xué)liu.chao.home孫賢06南京醫(yī)科大學(xué)七年制臨床醫(yī)學(xué)yiyoubeibei成 員趙正宏06南京醫(yī)科大學(xué)七年制臨床醫(yī)學(xué)cocl2錢敏06南京醫(yī)科大學(xué)七年制臨床醫(yī)學(xué)qianmin_41奚曉雪06南京醫(yī)科大學(xué)七年制臨床醫(yī)學(xué)錢瑩瑩06南京醫(yī)科大學(xué)七年制臨床醫(yī)學(xué)abcdej.student導(dǎo) 師姓名郭 軍年齡39單位南醫(yī)大國家級基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)示范中心行政職務(wù)/專業(yè)技術(shù)職務(wù)副主任 副教授 碩導(dǎo)主要成果主要從事糖尿病及缺血性腦中風(fēng)分子機(jī)制研究，熟悉胰島細(xì)胞和神經(jīng)損傷的信號

3、轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。已在國際性學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表SCI論文10多篇，其中通訊作者5篇。江蘇省青藍(lán)工程青年骨干教師培養(yǎng)對象，已主持多項國家自然科學(xué)基金（No. ）和省基金（04KJB和H）的研究工作。教學(xué)中，承擔(dān)了大學(xué)生創(chuàng)新性實驗、臨床分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物和生物化學(xué)等多門主干課的主講工作。平時重視教學(xué)創(chuàng)新, 注重培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新思維和實際動手能力，深獲學(xué)生好評。2009年“大學(xué)生實踐教學(xué)”榮獲江蘇省高等教育教學(xué)一等獎。指導(dǎo)大學(xué)生撰寫論文有： 1 J. Neurosci. Res. 86(2008): 2733-2745. (SCI, IF=3.48)2 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報25(2009):316-32

4、03 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報22（2009）:531-5354 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志 5（2008）:169-173 5 醫(yī)學(xué)綜述 15（2009）:25-28等申請理由（一） 團(tuán)隊基本條件本創(chuàng)新團(tuán)隊由南京醫(yī)科大學(xué)七年制臨床醫(yī)學(xué)六位同學(xué)組成。三年的學(xué)習(xí)，我們積累了大量的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)知識；接觸了一些臨床的課程；掌握了基本的分子生物學(xué)技術(shù)。學(xué)校的優(yōu)秀氛圍，老師的殷切教導(dǎo)，自身的不斷提高，使得我們不僅僅滿足于書本上的知識，開始對疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療與預(yù)防產(chǎn)生濃厚的興趣，時常提出一些疑惑，爭相發(fā)表各自的見解，希望探求醫(yī)學(xué)的真諦。同時，學(xué)校豐富的實驗教學(xué)，開放的實驗室，自主學(xué)習(xí)的平臺也鍛煉了我們的動手能力，思維能力

5、和創(chuàng)新能力。因此，我們?nèi)找嫦Ｍ麉⑴c到以實踐為特點的醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中，進(jìn)一步夯實自身基礎(chǔ)知識，鍛煉自身基本技能，形成縝密的邏輯思維能力，精益求精，不斷發(fā)展。團(tuán)隊主持人柳超，現(xiàn)任06級七年制臨床四班班長，善于思考，勤于動手。大二暑假在校細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系李建民教授指導(dǎo)下進(jìn)行科研培訓(xùn)，大三上學(xué)期在校國家級實驗教學(xué)示范中心吳曉燕老師指導(dǎo)下完成了綠色熒光蛋白（GFP）在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的實驗，目前正在該中心培養(yǎng)293細(xì)胞。在校兩年期間獲兩次二等獎學(xué)金。孫賢，現(xiàn)擔(dān)任06級七年制臨床四班副班長，成績優(yōu)異，動手能力強(qiáng)，學(xué)習(xí)踏實，在校期間獲二等獎學(xué)金、一等獎學(xué)金及費孝通獎學(xué)金。趙正宏，現(xiàn)為06級七年制臨床

6、四班學(xué)習(xí)委員，成績優(yōu)異，思維敏捷，大二暑假與柳超一起在李建民老師實驗室進(jìn)行培訓(xùn)，期間表現(xiàn)出較強(qiáng)的理解能力與悟性，在校兩年分別獲二等、三等獎學(xué)金。錢敏，曾是06級七年制臨床三班團(tuán)支書，動手能力強(qiáng)，大二上半學(xué)期完成了一篇生理學(xué)自設(shè)計實驗，有相當(dāng)?shù)娜止芾砟芰σ约敖M織實施能力，在校兩年獲兩次三等獎，現(xiàn)已發(fā)展為中共預(yù)備黨員。奚曉雪，她是06級七年制臨床三班學(xué)習(xí)委員，性格細(xì)膩，善于處理數(shù)據(jù)，雖沒有經(jīng)過科研培訓(xùn)，但她扎實的基礎(chǔ)知識為其提供一定保障，在校兩年獲兩次二等獎學(xué)金。錢瑩瑩，成績名列前茅，英語及計算機(jī)水平較高，在校期間獲二等獎學(xué)金、一等獎學(xué)金及揚子江獎學(xué)金。團(tuán)隊各成員都將堅持不懈，開拓創(chuàng)新，希望通過

7、這次實踐創(chuàng)新訓(xùn)練培養(yǎng)科學(xué)素養(yǎng)，增強(qiáng)科研能力。（二） 立項依據(jù)（研究意義，國內(nèi)外研究現(xiàn)狀與存在問題，研究目標(biāo)和創(chuàng)新之處）國內(nèi)外研究現(xiàn)狀與存在問題：口服葡萄糖比靜脈注射更能促進(jìn)體內(nèi)胰島素的釋放，因為食物能刺激小腸分泌胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)，繼而刺激胰島-細(xì)胞分泌胰島素，穩(wěn)定體內(nèi)血糖環(huán)境1。Exendin-4是近年來開發(fā)的GLP-1類似物，被證實能促進(jìn)胰島細(xì)胞功能增強(qiáng)和作用中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制機(jī)體食物攝取2，是治療型糖尿病的有效藥物。最新研究發(fā)現(xiàn)3：Exendin-4也能減輕組織應(yīng)激損傷，對帕金森綜合癥和缺血性腦卒中等中樞神經(jīng)病變有很好的治療作用，但其機(jī)制不明。缺血性腦卒中是糖尿病的重要并發(fā)癥

8、和主要致死致殘因素4，據(jù)統(tǒng)計糖尿病性腦卒中的發(fā)生率是非糖尿病患者的3倍以上 1。持續(xù)高血糖除誘發(fā)阻塞性腦缺血損傷外，也能刺激體內(nèi)炎癥因子如IL-6、TNF-、CRP、MIF的生成，激活胞內(nèi)損傷信號通路；還能誘導(dǎo)線粒體電子傳遞鏈超氧化物產(chǎn)生過量和還原劑的減少，加劇缺血性腦損傷1。既然exendin-4能用于糖尿病的治療，那么它對糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥缺血性腦損傷是否有潛在作用呢？ 通過查閱文獻(xiàn)，我們了解到，作為GLP-1模擬物，exendin-4能直接激活GLP-1受體，上調(diào)腺苷酸環(huán)化酶，增加胞內(nèi)cAMP生成，激活多種保護(hù)信號蛋白5。另外exendin-4也能抑制炎癥因子誘導(dǎo)的JNK信號級聯(lián)，阻止胰

9、島細(xì)胞損傷6，這種抑制效應(yīng)并與PKA的活性上調(diào)密切聯(lián)系。JNK信號通路激活是缺血性神經(jīng)損傷的重要因素，其活性抑制能有效減輕腦損傷，促進(jìn)腦的學(xué)習(xí)和記憶功能的恢復(fù)7。同時，GLP-1受體在腦內(nèi)表達(dá)，并能介導(dǎo)GLP-1生物學(xué)效應(yīng)。因此，我們有理由認(rèn)為：exendin-4對糖尿病引起的缺血性腦損傷有潛在的治療作用。我們推測exendin-4對糖尿病性腦缺血損傷的治療作用，不僅與exendin-4改善胰島細(xì)胞功能，降低體內(nèi)血糖濃度有關(guān)，也能通過cAMP的生成，直接激活中樞神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)信號蛋白PKA，抑制JNK信號級聯(lián)，阻止缺血性腦損傷。本項目研究擬采用腦室給藥，觀察exendin-4對大鼠糖尿病性腦缺

10、血損傷的治療效果，同時結(jié)合GLP-1受體抑制劑（exendin-9）和PKA抑制劑（H-89），研究exendin-4能非依賴血糖降低的激活cAMP-PKA通路抑制JNK損傷性信號級聯(lián)。研究意義該研究能揭示exendin-4對糖尿病性腦卒中的潛在治療作用及其可能的機(jī)制，同時也拓展新藥的使用范圍，為臨床治療糖尿病性腦病提供新的治療手段和方法。（3） 參考文獻(xiàn)1 Allport LE, Baird TA, Davis SM. Hyperglycaemia and the ischaemic brain: continuous glucose monitoring and implications

11、for therapy. Curr Diabetes Rev 4(2008): 245-57 2 Wang W, Walker JR, Wang X, Tremblay MS, Lee JW, Wu X, Schultz PG. Identification of small-molecule inducers of pancreatic -cell expansion. PNAS 106(2009): 1427-32.3 Li Y, Perry T, Kindy MS, Harvey BK, Tweedie D, Holloway HW, Powers K, Shen H, Egan JM,

12、 Sambamurti K, Brossi A, Lahiri DK, Mattson MP, Hoffer BJ, Wang Y, Greig NH. GLP-1 receptor stimulation preserves primary cortical and dopaminergic neurons in cellular and rodent models of stroke and Parkinsonism. PNAS 106(2009): 1285-90.4 Buteau J. GLP-1 receptor signaling: effects on pancreatic be

13、ta-cell proliferation and survival. Diabetes Metab 34 (2008):S73-7.5 Brubaker PL, Drucker DJ. Minireview: Glucagon-like peptides regulate cell proliferation and apoptosis in the pancreas, gut, and central nervous system. Endocrinology 6 Ferdaoussi M, Abdelli S, Yang JY, Cornu M, Niederhauser G, Favr

14、e D, Widmann C, Regazzi R, Thorens B, Waeber G, Abderrahmani A. Exendin-4 Protects -Cells From Interleukin-1Induced Apoptosis by Interfering With the c-Jun NH2-Terminal Kinase Pathway. Diabetes 57(2008): 1205-15.7 Mehta SL, Manhas N, Raghubir R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing

15、novel therapeutics. Brain Res Rev 54(2007): 34-66.（4） 研究目標(biāo)：1.闡明腦室給予exendin-4對糖尿病性腦缺血損傷的治療效果。2.探明腦室注射exendin-4能非依賴血糖降低的激活PKA，抑制JNK信號級聯(lián)，減弱糖尿病性腦缺血損傷。（5）創(chuàng)新之處1.拓展新藥exendin-4對疾病治療的使用范圍。闡明exendin-4非依賴血糖降低、直接抑制糖尿病性腦缺血損傷的分子機(jī)制。2.采用動物模型，有效模擬糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥-缺血性腦中風(fēng)，研究更接近臨床治療機(jī)制。項目方案（包括項目的訓(xùn)練目標(biāo)、前期準(zhǔn)備、組織實施、過程管理、實踐環(huán)節(jié)、教師指導(dǎo)、項目

16、結(jié)題等） 訓(xùn)練目標(biāo)1. 培養(yǎng)獨立查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)能力，鍛煉獨立從事科研工作的能力。 2. 學(xué)會構(gòu)建糖尿病并發(fā)前腦缺血大鼠模型。3. 學(xué)會腦室注射、Y迷宮實驗、免疫組化等基本實驗技術(shù)。4. 學(xué)會數(shù)據(jù)分析和科研論文撰寫的基本方法。前期準(zhǔn)備1利用我校圖書館文獻(xiàn)檢索系統(tǒng)，查閱中英文科研資料，熟悉本研究相關(guān)的背景知識，并撰寫相關(guān)綜述。2在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，初步掌握了SD大鼠糖尿病前腦缺血模型的制備及腦室給藥技術(shù)。3逐步學(xué)習(xí)體外活性測定、Elisa、免疫印跡和免疫熒光組織化學(xué)等多種分子生物學(xué)實驗技術(shù)。4. 購買實驗動物及相關(guān)實驗藥品、試劑。（三） 組織實施本項目擬在2年完成，預(yù)期研究進(jìn)展如下：2009.06-2

17、010.06觀察缺血前腦室注射exendin-4對糖尿病大鼠缺血損傷過程中血糖、炎癥因子（IL-6、TNF-）、氧化酶（SOD、CAT）、海馬神經(jīng)元損傷（3d）和學(xué)習(xí)記憶功能（14d）的影響。2010.07-2011.06 采用GLP受體或PKA抑制劑（exendin-9或H-89），免疫印跡或免疫熒光觀察：糖尿病大鼠腦缺血再灌不同時間，exendin-4 是否通過激活GLP受體，上調(diào)PKA，抑制JNK活性。 整理數(shù)據(jù)，撰寫論文。（四） 研究內(nèi)容(1) 首先評價exendin-4能非依賴血糖降低的減輕糖尿病性腦缺血損傷和改善腦學(xué)習(xí)記憶功能的治療效果。建立糖尿病聯(lián)合四動脈前腦缺血模型，缺血6mi

18、n復(fù)灌不同時間，研究缺血前腦室給藥：exendin-4對大鼠血糖、炎癥因子（IL-6、TNF-）、胞內(nèi)氧化應(yīng)激（SOD、CAT）、海馬神經(jīng)元損傷（3d）和學(xué)習(xí)記憶功能（14d）的作用。(2) 運用腦室給藥研究：exendin-4能激活PKA抑制JNK信號級聯(lián)，減弱糖尿病性腦缺血損傷。1采用PKA抑制劑（H-89），免疫印跡和免疫熒光觀察：糖尿病大鼠腦缺血再灌不同時間，exendin-4是否能通過PKA激活抑制JNK活性。2結(jié)合GLP受體抑制劑（exendin-9）評價GLP受體的阻斷可能抑制PKA繼而上調(diào)JNK活性，加重糖尿病大鼠缺血損傷。（五） 過程管理：委托學(xué)校教務(wù)處全程監(jiān)督，按學(xué)期考核。

19、每個月定期向指導(dǎo)老師匯報實驗工作設(shè)想和工作進(jìn)展。（六） 實踐環(huán)節(jié)（1） 研究方案1.糖尿病并發(fā)前腦缺血大鼠模型的建立雄性SD 大鼠禁食12h后稱重,選用體重180220g的大鼠,按50mg/ kg劑量尾部靜脈注射STZ 液,在自由進(jìn)食水的情況下飼養(yǎng)。4天后大鼠空腹血糖16.7mmol/ L認(rèn)為糖尿病模型成功。隨后飼養(yǎng)6周后，建立SD大鼠四動脈結(jié)扎前腦缺血模型；缺血6min后再灌不同時間，海馬分CA1和CA3/DG區(qū)。 2.腦室注射：PKA抑制劑H-89、exendin-4、GLP受體抑制劑exendin-91.5mm鉆頭腦顱鉆孔，位置為：前囟后0.8mm，旁開：1.5mm；下針深度：從顱骨表面

20、向下3.5mm。 3.焦油紫染色觀察：海馬組織損傷腦切片(5m) 貼片后自然干燥、焦油紫染色, 常規(guī)分色、脫水、透明、封固后鏡檢，測定CA1區(qū)1mm2的細(xì)胞數(shù)量。4. ELISA法測定：血清IL-6、TNF-等炎癥因子含量變化分離血清保存-20冰箱,使用雙抗體夾心ELISA法,用酶標(biāo)儀測定其OD值。5.試劑盒檢測：超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性變化提取海馬組織胞內(nèi)蛋白，采用黃嘌呤氧化酶法和可見光法測定超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性變化。6. 免疫印跡：胞內(nèi)蛋白活性及含量變化提取細(xì)胞蛋白，SDS分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉、抗p-PKA、p-JNK及其非磷酸化抗體孵育，HRP偶聯(lián)二抗

21、檢測，膠片顯影后評價結(jié)果。7.免疫組織熒光染色：海馬不同腦區(qū)蛋白活性變化冰凍切片處理后，3%多聚甲醛固定，4% FBS封閉，一抗孵育，二抗結(jié)合，封片后置于熒光顯微鏡（Carl Zeiss）下觀察。8. Y迷宮實驗評價：大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力固定測試時段，每只大鼠訓(xùn)練10次，逃避到安全區(qū)的正確率達(dá)到90%以上為學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)，記錄學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)時的訓(xùn)練次數(shù)，為學(xué)習(xí)能力；24h后再進(jìn)行10次檢測，記下正確逃避電擊的次數(shù)。學(xué)習(xí)次數(shù)越多表明學(xué)習(xí)能力越差，正確記憶次數(shù)越少表明記憶能力越低。技術(shù)路線前腦缺血模型的建立前腦缺血模型的建立（4-VO）糖尿病大鼠模型的構(gòu)建缺血前腦室注射exendin-4, H-89, exendin-9大鼠缺血6min,再灌1或24h血漿檢測：血糖含量焦油紫染色：神經(jīng)損傷ELISA評價：IL-6、TNF-含量免疫印跡或熒光：蛋白活性迷宮實驗：學(xué)習(xí)記憶功能試劑盒檢測：SOD和CAT教師指導(dǎo)指導(dǎo)課題的具體設(shè)計；培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新性的科研思維。負(fù)責(zé)前期準(zhǔn)備工作，提供必要的場所、儀器和試劑，保證課題的順利進(jìn)行。負(fù)責(zé)相關(guān)實驗技術(shù)的培訓(xùn)，培養(yǎng)學(xué)生實際動手和分析、解決問題的能力。負(fù)責(zé)指導(dǎo)相關(guān)實驗數(shù)據(jù)的處理和論文撰寫。項目結(jié)題擬2年內(nèi)完成、研究成果將以論文