基于超微電極的無標(biāo)記均相電化學(xué)DNA傳感器

1、基于超微電極的無標(biāo)記均相電化學(xué)DNA傳感器摘要：特定序列核酸的檢測在臨床病原體檢測、癌癥早期診斷以及遺傳病確診等方面至關(guān)重要。無標(biāo)記均相電化學(xué) 傳感器在低消耗、低成本、易操作、快速檢測和高重復(fù)性等方面具有顯著的優(yōu)勢。我們基于復(fù)合功能核酸分子和超 微電極檢測裝置，構(gòu)建了無標(biāo)記均相電化學(xué)核酸傳感器，用于PIK3CA循環(huán)腫瘤DNA（ ctDNA）的高特異性檢測。將 PIK3CA ctDNA互補(bǔ)序列和G-四聚體脫氧核酶偶聯(lián)，分別作為目標(biāo)識(shí)別元件和信號(hào)轉(zhuǎn)換元件，設(shè)計(jì)了具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單 鏈DNA,其中G-四聚體和ctDNA互補(bǔ)序列通過堿基互補(bǔ)被封閉。當(dāng)目標(biāo)DNA即PIK3CA與其互補(bǔ)序列特異性結(jié)合后會(huì) 導(dǎo)

2、致DNA構(gòu)象變化，釋放G-四聚體并發(fā)揮過氧化物酶的活性，催化H2O2和對苯二酚（HQ）反應(yīng)，產(chǎn)生對苯（ BQ） 和水。使用碳纖維超微電極微型電化學(xué)裝置對微升體積樣本中HQ和BQ的氧化還原電流信號(hào)進(jìn)行檢測。結(jié)果表明： 氧化還原電流信號(hào)隨目標(biāo)DNA分子濃度變化而變化，檢測限達(dá)20 nM，可有效區(qū)分完全互補(bǔ)序列和單堿基錯(cuò)配序列 DNA。此外，在血清摻雜樣本中該傳感器表現(xiàn)出類似的檢測效果。本研究設(shè)計(jì)的電化學(xué)生物傳感器實(shí)現(xiàn)了微升體積內(nèi) ctDNA的高性能檢測，為特定病原體或腫瘤基因的靶向DNA序列檢測提供了一種新思路，在醫(yī)學(xué)診斷和便攜式檢測中 具有廣闊的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：G-四聚體脫氧核酶；超微電極；氯

3、化高鐵血紅素；PIK3CA循環(huán)腫瘤DNA；循環(huán)伏安法Homogeneous Label-Free Electrochemical DNA Sensor Based onUltramicroelectrodesAbstract: The detection of specific sequence of nucleic acids is of significant importance in clinical pathogen detection, early diagnosis of cancer and diagnosis of genetic diseases. Among the va

4、rious detection techniques, homogenous label-free electrochemical assay showed excellent performance like low cost, easy operation, rapid detection, and high repeatability. In this work, we designed a homogenous label-free DNA sensor based on the combination of ultramicroelectrodes and functional nu

5、cleic acid for the sensing of PIK3CA circulating tumor DNA (ctDNA). The functional nucleic acid consists of a G-quadruplex sequence and a complementary sequence of PIK3CA ctDNA, which were both elaborately blocked via base pairing in a stem-ring structure. The presence of ctDNA can trigger the confo

6、rmation switching and therefore released G-quadruplex part and turned on DNAzyme activity. The carbon fiber electrode based miniaturized electrochemical device was applied to the detection of homogeneous DNAzyme catalytic activity at the microliter level. The proposed DNA sensor showed dose-dependen

7、t responses to PIK3CA with high specificity, which provided a simple and rapid strategy for the construction of homogeneous label-free electrochemical DNA biosensors.1、引言在醫(yī)學(xué)和基因?qū)W的發(fā)展領(lǐng)域中，特定序列核 酸的檢測在臨床病原體檢測、癌癥早期診斷以及 遺傳病確診等方面至關(guān)重要1, J目前特定序列 核酸的檢測主要采用各種表征技術(shù)和分離技術(shù)通 過信號(hào)轉(zhuǎn)換達(dá)到檢測的目的。表征技術(shù)主要有熒 光，比色，表面等離子體共振（Surface

8、 Plasmon Resonance， SPR），石英晶體微天平（Quartz Crystal Microbalance， QCM），電化學(xué)分析等； 分離技術(shù)有色譜法和毛細(xì)管電泳法等。電化學(xué)生 物傳感器將電化學(xué)的簡便、快速、高靈敏度、樣 品用量少、價(jià)格低廉與生物分子識(shí)別的高效、專 一、高選擇性相結(jié)合3，較其他傳感器具有顯著的 優(yōu)勢。電化學(xué)分析主要以異相方法為主體，將生 物敏感元件通過物理或化學(xué)方法固定在傳感器芯 片表面，可對目標(biāo)物進(jìn)行高靈敏檢測網(wǎng)。相比異相 方法，均相電化學(xué)傳感器不僅保留了電化學(xué)生物 傳感器本來的優(yōu)勢，還具有低成本、易操作、現(xiàn) 場混合即測、高重復(fù)性、最大程度保留生物分子 的活性

9、、提高反應(yīng)效率等優(yōu)勢琴。超微電極是至少在一個(gè)維度上小于25 pm的 電極，與常規(guī)電極相比，超微電極具有一些獨(dú)特 的電化學(xué)特性，如雙電層電容小，信噪比高，1R 降（歐姆壓降）小，傳質(zhì)速率高，穩(wěn)態(tài)電流定量 性好等9。這些特點(diǎn)使其在電化學(xué)生物傳感器的設(shè) 計(jì)和微型化中具有廣闊的發(fā)展前景?；谔祭w維 的超微電極的制作成本低，機(jī)械強(qiáng)度高，已被用 于均相電化學(xué)分析檢測中10，13。脫氧核酶是一種由指數(shù)富集的配體進(jìn)化技術(shù) （Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment， SELEX ）篩選的具有催化作用的單 鏈DNA片段14。其中應(yīng)用較為廣

10、泛的是G-四聚 體脫氧核酶，它通過G-四聚體與氯化高鐵血紅素 （Hemin ）結(jié)合形成G-四聚體/hemin復(fù)合物，具有 類似于辣根過氧化物酶的催化活性，催化過氧化 氫和對苯二酚（HQ）反應(yīng)。脫氧核酶作為信號(hào)轉(zhuǎn) 換元件，通過設(shè)計(jì)可以與具有特異識(shí)別性能的核 酸序列（如核酸適體、互補(bǔ)序列）整合到一個(gè)單 鏈DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，不需要額外的標(biāo)記或修飾， 可被靈活的應(yīng)用于各種無標(biāo)記生物傳感器的構(gòu)建 中15, 17本研究基于碳纖維超微電極的微型電化學(xué) 裝置，選取PIK3CA循環(huán)腫瘤DNA（ Circulating Tumor DNA，ctDNA）為目標(biāo)分子18，通過設(shè)計(jì) 復(fù)合功能核酸結(jié)構(gòu)，以G-四聚體脫氧核

11、酶作為 信號(hào)轉(zhuǎn)換元件，ctDNA互補(bǔ)序列DNA為信號(hào)識(shí)別 元件，構(gòu)建無標(biāo)記均相電化學(xué)核酸傳感器，用于 DNA分子的高性能檢測。PIK3CA為腫瘤常見的分 子標(biāo)志物，其活性的增加與多種癌癥的發(fā)生和發(fā) 展相關(guān)。本工作對目標(biāo)DNA分子在血清摻雜樣中 的檢出限為20 nM，且能對單堿基錯(cuò)配序列進(jìn)行識(shí) 別。這種簡單、快速的“混合-測量”模式為特定 病原體或腫瘤基因的目標(biāo)DNA序列檢測提供了新 的思路和方向。2、材料與方法2.1試劑DNA序列由生工生物工程（上海）股份有限 公司合成，包括：目標(biāo)DNA序列：5 - AGTGATTTTAGAGAGAG -3 , PIK3CA 單個(gè)堿基錯(cuò)配序列：5 - AGTG

12、ATTTAAGAGAGAG -3 , ctDNA m1兩個(gè)堿基錯(cuò)配序列：5 - AGAGATTTAAGAGAGAG -3 , ctDNA m2三個(gè)堿基錯(cuò)配序列：5- AGAGATTTAAGAGTGAG -3, ctDNA m3G-四聚體脫氧核酶：5 - CTGGGAGGGAGGGAGGGA -3, EAD2PIK3CA互補(bǔ)序列偶聯(lián)G-四聚體脫氧核酶的具 有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈DNA:5 - CTGGGAGGGAGGGAGGGAAG TGATCTCTCTCTAAAATCACTTCCC -3 ， CDNA-G4，（粗體部分為G-四聚體脫氧核酶 EAD2，斜體部分為PIK3CA ctDNA的互補(bǔ)鏈）二甲亞

13、砜（DMSO），Na2HPO4-12H2O， NaH2PO4，KCl，Hemin，HQ，H2O2均購自中國國 藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（中國，上海），胎牛 血清購于Thermo Fisher。核酸溶于0.1 M pH 7.4含 有5 mM KCl的磷酸鹽緩沖液（PB ）中。Hemin（ 5 mM）溶于DMSO中，然后使用含有0.01% Triton X-100的PB溶液稀釋至100 M。使用水為Milli-Q 純水系統(tǒng)（Bedford, MA）制得的超純水（18.2 MQ-cm）。2.2碳纖維超微電極的制備碳纖維（直徑7日m）依次在丙酮，乙醇和 純水中超聲清洗5 min，在空氣中晾干。取一根 長

14、度約1 cm的碳纖維，將其一端與銅絲（直徑0.2 mm）的一端用導(dǎo)電銀漆粘連，露出約3 mm長度 作為工作電極，晾干；將銅絲的另一端從玻璃毛 細(xì)管（長10 cm，外徑1.50 mm ，內(nèi)徑1.17 mm） 中穿入，使用硅橡膠封閉露出碳纖維的玻璃毛細(xì) 管端口，并用雙組份環(huán)氧樹脂封閉玻璃毛細(xì)管另 一端端口，以固定銅絲；待硅橡膠和雙組份環(huán)氧 樹脂固化，碳纖維超微電極制作完成。為了得到 清潔的碳纖維電極表面，可將制作成功的碳纖維 超微電極在酒精燈外焰快速掠過。2.3電化學(xué)測定將使用CHI 660C上海辰華電化學(xué)工作站進(jìn)行 電化學(xué)測試，微型電化學(xué)測量裝置如圖1右所示。 測量時(shí)，首先將固定體積（40）的樣

15、品溶液吸入槍頭內(nèi)，然后將制備好的碳纖維超微電極插 入槍頭內(nèi)固定住，再將整個(gè)槍頭插入裝有與樣品 溶液相同的緩沖溶液的玻璃檢測池中。采用三電 極測量體系，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲為對電 極，碳纖維超微電極為工作電極。為驗(yàn)證碳纖維 超微電極用于電化學(xué)檢測的可行性，將制備得到 的超微電極分別置于5 mM K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6 溶液和1 mM HQ溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安（Cyclic Voltammetry，CV）曲線掃描，掃描速度為100 mV/so圖1基于超微電極的無標(biāo)記電化學(xué)DNA傳感器的原理示 意圖Fig.1. The schematic diagram of homogen

16、eous label-free electrochemical DNA sensor based on ultramicroelectrodesG-四聚體脫氧核酶的酶催化活性檢測將不同濃度（0 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1日M ）的EAD2與固定濃度的Hemin、HQ和 H2O2混合得到40由檢測溶液，其中Hemin、HQ 和H2O2的最終濃度分別為4日M, 1 mM和2 mM。 如未作特殊說明，后面步驟所使用的Hemin、HQ 和H2O2均為此濃度，檢測溶液總體積均為40 pL。 混合3 min后掃描CV曲線。PB溶液中PIK3CA的檢測將不同濃度（0 nM、2 nM、20

17、nM、200 nM、2 日M）的PIK3CA與2 日M cDNA-G4混合，使 用ctDNA m 1，ctDNA m2和ctDNA m3作為對照， 在恒溫金屬浴裝置中恒溫25孵育1小時(shí)，使其充 分反應(yīng)。分別加入Hemin、HQ和壓。2,混合5 min 后掃描CV曲線。2.6血清摻雜溶液中PIK3CA的檢測在含10%胎牛血清的PB溶液中加入不同濃 度(0 nM、2 nM、20 nM、200 nM、2 日M )的 PIK3CA與2日M cDNA-G4,在恒溫金屬浴裝置 中恒溫25孵育1小時(shí)。再將其與Hemin、HQ和 H2O2混合，CV掃描過程同上一步。3、結(jié)果與討論3.1碳纖維超微電極電化學(xué)測試

18、為驗(yàn)證基于碳纖維超級電極的微型電化學(xué) 檢測裝置用于電化學(xué)測試的可行性，將制備得 到的超微電極分別置于40嘰5 mM K3Fe(CN)6/ K4Fe(CN)6和1 mM HQ溶液中進(jìn)行CV曲線掃描。 如圖2所示，在K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和HQ溶液 中，電極的CV曲線均表現(xiàn)為柱狀超微電極的準(zhǔn)穩(wěn) 態(tài)電流特征，與文獻(xiàn)報(bào)道一致19，其中圖A表現(xiàn)為 Fe(CN)62+的氧化電流和Fe(CN)63+的還原電流，圖B 主要反映了HQ的氧化電流。圖2碳纖維超微電極在含有40 uL (A) 5 mM K3Fe(CN)6/ K4Fe(CN)6溶液和(B) 1 mM HQ溶液槍頭中CV圖Fig.2.

19、Cyclic voltammetry (CV) results of carbon fiber ultramicroelectrode measured in (A) 5 mM K3Fe(CN/ K4Fe(CN)6 and (B)1 mM HQ solution3.2 G-四聚體脫氧核酶的酶催化活性G-四聚體與Hemin結(jié)合后形成G-四聚體/hemin 脫氧核酶，可催化HQ和H2O2反應(yīng)產(chǎn)生對苯醌 (BQ)和H2O。超微電極具有準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)電流特征， 根據(jù)準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)電流方程，氧化電流與HQ的物質(zhì)濃度 成正比，還原電流與BQ的物質(zhì)濃度成正比。從圖 3可知，當(dāng)溶液中不含有EAD2時(shí)，Hemin的催化 活性較

20、弱，HQ與H2O2幾乎不反應(yīng)，表現(xiàn)出HQ的 氧化電流。隨著加入EAD2濃度的增加(1 nM-1 pM),酶促反應(yīng)的進(jìn)行使得CV曲線的氧化電流 降低，還原電流增加，這表明基于碳纖維超微電 極的微型電化學(xué)檢測裝置可在均相中成功檢測出 G-四聚體脫氧核酶的催化活性。0.4-a-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6電壓/V圖3 不同濃度EAD2： (a) 0, (b) 1 nM, (c) 10 nM, (d) 100 nM, (e) 1 u M與1 mM HQ, 1 mM H2O2, 4 uM Hemin 溶液混合3 min后測得的CV圖Fig.3. CV curves of differ

21、ent concentrations of EAD2: (a) 0, (b) 1 nM, (c) 10 nM, (d) 100 nM, (e) 1 u M mixed with1 mM HQ, 1 mM H2O2, 4 u M Hemin measured at 3 min3.3磷酸緩沖液中目標(biāo)DNA的檢測為實(shí)現(xiàn)PIK3CA ctDNA均相無標(biāo)記檢測，我們 設(shè)計(jì)了一條包含有PIK3CA互補(bǔ)序列和G-四聚體的 單鏈DNA分子，其中G-四聚體通過堿基互補(bǔ)被封 閉。當(dāng)目標(biāo)DNA即PIK3CA與其互補(bǔ)序列特異性結(jié) 合后會(huì)導(dǎo)致DNA構(gòu)象變化，釋放G-四聚體與溶液 中的Hemin結(jié)合發(fā)揮過氧化物酶的活性。

22、碳纖維 超微電極用于檢測目標(biāo)DNA分子誘發(fā)的體系氧化 還原電流的變化。如圖6a所示，當(dāng)溶液中不存在 PIK3CA ctDNA序列時(shí)，HQ與H2O2幾乎不反應(yīng)， CV曲線主要表現(xiàn)為HQ的氧化電流；當(dāng)PIK3CA DNA濃度為2 nM時(shí)也幾乎觀察不到氧化還原電 流的變化；隨著目標(biāo)DNA分子濃度繼續(xù)增加(20 nM-2日M), HQ的氧化電流逐漸降低，BQ的還原 電流逐漸升高，表明釋放出的G-四聚體的濃度逐 漸升高，從而與Hemin結(jié)合形成的過氧化物酶的濃 度也逐漸升高。圖6b為氧化電流的變化值(10-1)/10 與目標(biāo)DNA分子濃度的關(guān)系曲線，本傳感器能檢 測出的目標(biāo)DNA最低濃度約為20 nM。

23、-0.2 -0.1 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.410100 WOO電壓/V濃度/nM(A)(B)圖4(A)不同濃度PIK3CA： (a) 0, (b) 2 nM, (c) 20 nM, (d) 200 nM，(e) 2 u M 和1 mM HQ, 1 mM H2O2, 4 u M Hemin, 2 uM cDNA G4在PB溶液中混合5 min后測得的 CV圖；(B)氧化電流變化值(i0-i)/i0與目標(biāo)DNA分子濃度 的校準(zhǔn)曲線(i0和分別為無目標(biāo)DNA和有目標(biāo)DNA時(shí)的氧化 電流值，n = 3 )Fig.4. (A) CV curves of differen

24、t concentrations of PIK3CA: (a) 0, (b) 2 nM, (c) 20 nM, (d) 200 nM, (e) 2 u M mixed with 1 mM HQ, 2 mM H2O2, 4 uM Hemin, 2 uM cDNA G4 in PB solution measured at 5 min; (B) The change of oxide currents depends on concentrations of PIK3CA, n = 3為驗(yàn)證本傳感器的檢測特異性，我們將cDNA G4分別與三堿基錯(cuò)配、二堿基錯(cuò)配、單堿基錯(cuò) 配的DNA序列混合測量CV

25、曲線。結(jié)果表明（圖 5），與完全互補(bǔ)序列相比，三堿基錯(cuò)配、二堿基 錯(cuò)配和單堿基錯(cuò)配DNA序列幾乎不引起CV曲線的 變化，即不觸發(fā)過氧化物酶的催化活性，表明本 工作設(shè)計(jì)DNA傳感器具有良好的選擇性。-0.2-0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4電壓/V圖5 (a) 2 u M cDNA G4, (b) 2 u M ctDNA ml + 2 u M cDNA G4, (c) 2 uM ctDNA m2 + 2 uM cDNA G4, (d) 2 uM ctDNA m3 + 2 uM cDNA G4, (e) 2 uM PIK3CA + 2 u M cDNA G4與1 mM HQ

26、, 2 mM H2O2, 4 uM Hemin 混合 5 min后測得的CV圖Fig.5. CV curves of (a) 2 u M cDNA G4, (b) 2 u M ctDNA m1 + 2 u M cDNA G4, (c) 2 u M ctDNA m2 + 2 u M cDNA G4, (d) 2 u M ctDNA m3 + 2 u M cDNA G4, (e) 2 u M PIK3CA + 2 uM cDNA G41 mixed with 1 mM HQ, 2 mM H2O2, 4 u M Hemin measured at 5 min3.4血清摻雜樣中目標(biāo)DNA的檢測為評估傳

27、感器在復(fù)雜環(huán)境的檢測能力，我們 在PB溶液中加入10%胎牛血清作為干擾因素， 檢測其對目標(biāo)DNA的響應(yīng)。結(jié)果顯示（圖6A和 6B）,傳感器的響應(yīng)趨勢與在PB溶液中基本保持 一致，最低檢測限也為20 nM左右，表明本工作設(shè) 計(jì)的均相無標(biāo)記DNA傳感器具有臨床應(yīng)用的價(jià)值 和潛能。然而，相比于PB溶液，在血清溶液中相 同濃度的目標(biāo)DNA引起氧化電流變化值較小。為 研究這一變化原因，我們分別對比了血清摻雜樣 和PB緩沖液中加入HQ，HQ + H2O2，HQ + H2O2 + Hemin + EAD2，HQ + H2O2 + Hemin + EAD2的 CV曲線。圖6(A)不同濃度PIK3CA： (a)

28、 0, (b) 2 nM, (c) 20 nM, (d) 200 nM, (e) 2 uM與1 mM HQ, 1 mM H2O2, 4 uM Hemin, 2 uM cDNA G4在含10%胎牛血清PB溶液中混 合5 min后測得的CV圖；(B)血清摻雜溶液中氧化電流變 化值(i0-i)/i0與目標(biāo)DNA分子濃度的校準(zhǔn)曲線(i0和i分別為無 目標(biāo)DNA和有目標(biāo)DNA時(shí)的氧化電流值)Fig.6. (A) CV curves of different concentrations of PIK3CA: (a) 0, (b) 2 nM, (c) 20 nM, (d) 200 nM, (e) 2 u M mixed with 1 mM HQ, 2 mM H2O2, 4 uM Hemin, 2 u M cDNA in 10% FBS PB solution measured at 5 min; (b) The change of oxide currents depends on concentrations ofPIK3CA, n=3結(jié)果如圖7所示，當(dāng)且僅當(dāng)EAD2, Hemin和 氧化還原底物同時(shí)存在時(shí)，血清摻雜樣的氧化電 流相對較高，即酶促