SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量ppt-Powe

1、SDS電泳測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牧私釹DS垂直板板型電泳泳法的基基本原理理及操作作技術(shù)。學(xué)習(xí)并掌掌握SDSPAGE法測(cè)定定蛋白質(zhì)質(zhì)相對(duì)分分子量的的技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理理SDS-電泳泳法，即即十二烷烷基硫酸酸鈉聚聚丙烯酰酰胺凝膠膠電泳法法，。1在蛋蛋白質(zhì)混混合樣品品中各蛋蛋白質(zhì)組組分的遷遷移率主主要取決決于分子子大小和和形狀以以及所帶帶電荷多多少。2在聚聚丙烯酰酰胺凝膠膠系統(tǒng)中中，加入入一定量量的十二二烷基硫硫酸鈉（SDS），SDS是是一種陰陰離子表表面活性性劑，加加入到電電泳系統(tǒng)統(tǒng)中能使使蛋白質(zhì)質(zhì)的氫鍵鍵和疏水水鍵打開(kāi)開(kāi)，并結(jié)結(jié)合到蛋蛋白質(zhì)分分子上（在一定定條件下下，大多多數(shù)蛋白白質(zhì)與SD

2、S的的結(jié)合比比為1.4gSDS/1g蛋蛋白質(zhì)），使各各種蛋白白質(zhì)SDS復(fù)復(fù)合物都都帶上相相同密度度的負(fù)電電荷，其其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)過(guò)了蛋白白質(zhì)分子子原有的的電荷量量，從而而掩蓋了了不同種種類蛋白白質(zhì)間原原有的電電荷差別別。此時(shí)時(shí)，蛋白白質(zhì)分子子的電泳泳遷移率率主要取取決于它它的分子子量大小小，而其其它因素素對(duì)電泳泳遷移率率的影響響幾乎可可以忽略略不計(jì)。3.當(dāng)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)的分子子量之間時(shí)，電泳遷遷移率與與分子量量的對(duì)數(shù)數(shù)值呈直直線關(guān)系系，符合合下列方方程：1gMr =KbmR式中：Mr為蛋蛋白質(zhì)的的分子量量；K為常數(shù)；b為斜率；mR為相對(duì)遷遷移率。在條件件一定時(shí)時(shí)，b和和K

3、均為為常數(shù)。若將已知知分子量量的標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)蛋白質(zhì)質(zhì)的遷移移率對(duì)分分子量的的對(duì)數(shù)作作圖，可可獲得一一條標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線。未知蛋蛋白質(zhì)在在相同條條件下進(jìn)進(jìn)行電泳泳，根據(jù)據(jù)它的電電泳遷移移率即可可在標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線上上求得分分子量。儀器、原原料和試試劑儀器：垂垂直板型型電泳槽槽；直流流穩(wěn)壓電電源；50或100l微量量注射器器、玻璃璃板、水水浴鍋，染色槽槽；燒杯杯；吸量量管；常常頭滴管管等。原料：低低分子量量標(biāo)準(zhǔn)蛋蛋白質(zhì)按按照每種種蛋白0.51mgml-1樣樣品溶解解液配制制。可配配制成單單一蛋白白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)液，也也可配成成混合蛋蛋白質(zhì)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液。試劑：（1）分分離膠緩緩沖液（Tris-HCl緩緩沖液PH8.9）:取1m

4、ol/L鹽鹽酸48mL，Tris36.3g,用用無(wú)離子子水溶解解后定容容至100mL。（2）濃濃縮膠緩緩沖液（Tris-HCl緩緩沖液PH6.7）:取1mol/L鹽鹽酸48mL, Tris5.98g,用無(wú)離離子水溶溶解后定定容至100mL。（3）30%分分離膠貯貯液：配配制方法法與連續(xù)續(xù)體系相相同，稱稱丙烯酰酰胺（Acr） 30g及N，N-甲叉叉雙丙烯烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重重蒸水中中，最后后定容至至100ml，過(guò)濾后后置棕色色試劑瓶瓶中，4保存存。（4）10%濃濃縮膠貯貯液：稱稱Acr 10g及Bis0.5g，溶溶于重蒸蒸水中，最后定定容至100mL，過(guò)過(guò)濾后置置棕色試試劑瓶中中，4

5、貯存。（5）10%SDS溶溶液：SDS在在低溫易易析出結(jié)結(jié)晶，用用前微熱熱，使其其完全溶溶解。（6）1%TEMED；（7）10%過(guò)過(guò)硫酸銨銨（AP）：現(xiàn)現(xiàn)用現(xiàn)配配。（8）電電泳緩沖沖液（Tris-甘氨氨酸緩沖沖液PH8.3）:稱稱取Tris6.0g,甘甘氨酸酸28.8g, SDS1.0g,用用無(wú)離子子水溶解解后定容容至1L。（9）樣樣品溶解解液：取取SDS 100mg，巰基基乙醇0.1mL，甘甘油1mL，溴溴酚藍(lán)2mg，0.2mol/L，pH7.2磷磷酸緩沖沖液0.5mL，加重重蒸水至至10mL（遇遇液體樣樣品濃度度增加一一倍配制制）。用用來(lái)溶解解標(biāo)準(zhǔn)蛋蛋白質(zhì)及及待測(cè)固固體。（10）染色液液：

6、0.25g考馬斯斯亮藍(lán)G-250，加加入454mL 50%甲醇醇溶液和和46mL冰乙乙酸即可可。（11）脫色液液：75mL冰冰乙酸，875mL重重蒸水與與50mL甲醇醇混勻。實(shí)驗(yàn)步驟驟1安安裝夾心心式垂直直板電泳泳槽：目目前，夾夾心式垂垂直板電電泳槽有有很多型型號(hào)，雖雖然設(shè)置置略有不不同，但但主要結(jié)結(jié)構(gòu)相同同，且操操作簡(jiǎn)單單，不易易泄漏。同學(xué)們們可根據(jù)據(jù)具體不不同型號(hào)號(hào)要求進(jìn)進(jìn)行操作作。主要要注意：安裝前前，膠條條、玻板板、槽子子都要潔潔凈干燥燥；勿用用手接觸觸灌膠面面的玻璃璃。2配膠膠：根據(jù)據(jù)所測(cè)蛋蛋白質(zhì)分分子量范范圍，選選擇適宜宜的分離離膠濃度度。本實(shí)實(shí)驗(yàn)采用用SDS不不連續(xù)系系統(tǒng)，按按下

7、表的的配制分分離膠和和濃縮膠膠。試劑名稱配制20ml不同濃度分離膠所需各種試劑用量/ml配制10ml濃縮膠所需試劑用量5%7.5%10%15%3%分離膠貯液（30%Acr-0.8%Bis)3.335.006.6610.00-分離膠緩沖液（pH8.9Tris-HCl）2.502.502.502.50-濃縮膠貯液（10%Acr-0.5%Bis）-3.0濃縮膠緩沖液（pH6.7 Tris-HCl）-1.2510% SDS 0.200.200.200.200.101%TEMED 2.002.002.002.002.00重蒸餾水 11.8710.208.545.204.60混勻后，置真空干燥器中，抽氣1

8、0min10%AP0.100.100.100.100.053制備備凝膠板板：（1）分分離膠制制備：按按表配制制20ml10%分分離膠，混勻后后用細(xì)長(zhǎng)長(zhǎng)頭滴管管將凝膠膠液加至至長(zhǎng)、短短玻璃板板間的縫縫隙內(nèi)，約8cm高，用1ml注射射器取少少許蒸餾餾水，沿沿長(zhǎng)玻璃璃板板壁壁緩慢注注入，約約34mm高高，以進(jìn)進(jìn)行水封封。約30min后，凝膠與與水封層層間出現(xiàn)現(xiàn)折射率率不同的的界線，則表示示凝膠完完全聚合合。傾去去水封層層的蒸餾餾水，再再用濾紙紙條吸去去多余水水分。（2）濃濃縮膠的的制備：按表配配制10ml3%濃濃縮膠，混勻后后用細(xì)長(zhǎng)長(zhǎng)頭滴管管將濃縮縮膠加到到已聚合合的分離離膠上方方，直至至距離短短玻

9、璃板板上緣約約0.5cm處處，輕輕輕將樣品品槽模板板插入濃濃縮膠內(nèi)內(nèi)，避免免帶入氣氣泡。約約30min后后凝膠聚聚合，再再放置2030min。待待凝膠凝凝固，小小心拔去去樣品槽槽模板，用窄條條濾紙吸吸去樣品品凹槽中中多余的的水分，將pH8.3 Tris-甘氨酸酸緩沖液液倒入上上、下貯貯槽中，應(yīng)沒(méi)過(guò)過(guò)短板約約0.5cm以以上，即即可準(zhǔn)備備加樣。4樣品品處理及及加樣各標(biāo)準(zhǔn)蛋蛋白及待待測(cè)蛋白白都用樣樣品溶解解液溶解解，使?jié)鉂舛葹?.51mg/mL，沸水水浴加熱熱3分鐘鐘，冷卻卻至室溫溫備用。處理好好的樣品品液如經(jīng)經(jīng)長(zhǎng)期存存放，使使用前應(yīng)應(yīng)在沸水水浴中加加熱1分分鐘，以以消除亞亞穩(wěn)態(tài)聚聚合。一般加樣樣

10、體積為為1015L（即即210g蛋白質(zhì)質(zhì)）。如如樣品較較稀，可可增加加加樣體積積。用微微量注射射器小心心將樣品品通過(guò)緩緩沖液加加到凝膠膠凹形樣樣品槽底底部，待待所有凹凹形樣品品槽內(nèi)都都加了樣樣品，即即可開(kāi)始始電泳。5電泳泳將直流穩(wěn)穩(wěn)壓電泳泳儀開(kāi)關(guān)關(guān)打開(kāi)，開(kāi)始時(shí)時(shí)將電流流調(diào)至10mA。待樣樣品進(jìn)入入分離較較時(shí)，將將電流調(diào)調(diào)至2030 mA。當(dāng)藍(lán)藍(lán)色染料料遷移至至底部時(shí)時(shí)，將電電流調(diào)回回到零，關(guān)閉電電源。拔拔掉固定定板，取取出玻璃璃板，用用刀片輕輕輕將一一塊玻璃璃撬開(kāi)移移去，在在膠板一一端切除除一角作作為標(biāo)記記，將膠膠板移至至大培養(yǎng)養(yǎng)皿中染染色。6染色色及脫色色將染色液液倒入培培養(yǎng)皿中中，染色色1

11、h左右，用蒸餾餾水漂洗洗數(shù)次，再用脫脫色液脫脫色，直直到蛋白白區(qū)帶清清晰，即即用直尺尺分別量量取各條條帶與凝凝膠頂端端的距離離。計(jì)算1.相對(duì)對(duì)遷移率率mR=樣品品遷移距距離（cm）/染料遷遷移距離離（cm）2.以標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)蛋白白質(zhì)分子子量的對(duì)對(duì)數(shù)對(duì)相相對(duì)遷移移率作圖圖，得到到標(biāo)準(zhǔn)曲曲線，根根據(jù)待測(cè)測(cè)樣品相相對(duì)遷移移率，從從標(biāo)準(zhǔn)曲曲線上查查出其分分子量。注意事項(xiàng)項(xiàng)1.不不是是所有的的蛋白質(zhì)質(zhì)都能用用SDS-凝膠膠電泳法法測(cè)定其其分子量量，已發(fā)發(fā)現(xiàn)有些些蛋白質(zhì)質(zhì)用這種種方法測(cè)測(cè)出的分分子量是是不可靠靠的。包包括：電電荷異常?；驑?gòu)象象異常的的蛋白質(zhì)質(zhì)，帶有有較大輔輔基的蛋蛋白質(zhì)（如某些些糖蛋白白）以及及

12、一些結(jié)結(jié)構(gòu)蛋白白如膠原原蛋白等等。例如如組蛋白白F1，它本身身帶有大大量正電電荷，因因此，盡盡管結(jié)合合了正常常比例的的SDS，仍不不能完全全掩蓋其其原有正正電荷的的影響，它的分分子量是是21,000，但SDS-凝膠電電泳測(cè)定定的結(jié)果果卻是35,000。因此，最好至至少用兩兩種方法法來(lái)測(cè)定定未知樣樣品的分分子量，互相驗(yàn)驗(yàn)證。2有許許多蛋白白質(zhì)，是是由亞基基（如血血紅蛋白白）或兩兩條以上上肽鏈（如-胰凝乳乳蛋白酶酶）組成成的，它它們?cè)赟DS和和巰基乙乙醇的作作用下，解離成成亞基或或單條肽肽鏈。因因此，對(duì)對(duì)于這一一類蛋白白質(zhì)，SDS-凝膠電電泳測(cè)定定的只是是它們的的亞基或或單條肽肽鏈的分分子量，而不是是完整分分子的分分子量。為了得得到更全全面的資資料，還還必須用用其它方方法測(cè)定定其分子子量及分分子中肽肽鏈的數(shù)數(shù)目等，與SDS-凝凝