一種聚丙烯酸接枝型熒光納米粒子的制備、性能及細胞成像

1、一種聚丙烯酸接枝型熒光納米粒子的制備、性能及細胞成像摘 要 將N氨基4N甲基哌嗪1，8萘酰亞胺AMN通過酰胺化反響接枝到聚丙烯酸鏈上，利用生成的聚合物在水溶液中的自組裝， 制備了一種水溶性熒光納米粒子PAAMN。采用紫外可見光譜、核磁共振氫譜、透射電鏡、動態(tài)光散射和熒光光譜方法對PAAMN進展了表征，MTT法檢測其細胞相容性，最后用熒光顯微鏡觀察其自身熒光及細胞成像效果。實驗結(jié)果說明， PAAMN為球狀構(gòu)造，萘酰亞胺熒光團的摩爾取代度為4.1%； 在生理pHl件下，以390 nm為激發(fā)波長，PAAMN在534 nm處發(fā)射較強的熒光，且光穩(wěn)定性較好； 在pH 4.010.0范圍內(nèi)，其熒光波長無明

2、顯變化，熒光強度隨pH值增大而逐漸減小，但pH敏感程度小于AMN。PAAMN具有良好的細胞相容性，能進入細胞，且在390 nm激發(fā)光下發(fā)射綠色熒光，可用于細胞成像。關(guān)鍵詞 熒光納米粒子； 聚丙烯酸； 萘酰亞胺； 自組裝； 細胞成像1 引 言熒光納米粒子是一類重要的納米功能材料，在細胞成像、疾病診斷及生物傳感等領(lǐng)域有廣闊的開展前景1，2，而具有良好水溶性、光穩(wěn)定性及低毒性是其在這些領(lǐng)域中應(yīng)用的前提。目前，基于無機材料的熒光納米粒子研究較為廣泛，如無機半導(dǎo)體量子點3、碳量子點4和金納米粒子5等，這些納米粒子常需要通過外表修飾或者聚合物包覆來進步其水溶性、可修飾性、生物相容性等特性。相對于無機熒光納

3、米粒子，有機聚合物熒光納米粒子在構(gòu)造多樣性和功能可設(shè)計性方面具有明顯優(yōu)勢，近年來引起了研究者的興趣610。聚合物納米粒子中熒光團的存在形式主要有兩種11，12： 一種是非共價結(jié)合，如在納米粒子制備過程中或者制備完成后，通過包埋或吸附方法負載熒光團； 另外一種是共價鍵合，如通過外表修飾方式將熒光團鍵合到無熒光的納米粒子上，或先制備熒光聚合物單體，再聚合形成納米粒子。利用生物相容性兩親聚合物的自組裝對熒光團進展包裹是制備熒光聚合物納米粒子的常用方法11，13，14，該方法簡單，得到的納米粒子水分散性及生物相容性良好，但由于熒光團以非共價方式結(jié)合，在使用過程中容易泄露。采用先將熒光團與聚合物共價結(jié)合

4、再進展自組裝的方法可以減少或防止染料泄露問題，有效進步熒光納米粒子的穩(wěn)定性，目前該類水溶性熒光納米粒子的研究報道較少1517。聚丙烯酸PAA是一種常用高分子材料，在化工、紡織、水處理、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛18，19。由于PAA無毒、易溶于水，且富含可功能化的羧基，近年來被研究者用于無機納米粒子的修飾制備有機無機復(fù)合納米材料20，21、與共價聚合物進展自組裝制備水溶性熒光納米粒子22、作為兩親聚合物的親水鏈段制備納米膠束23、進展交聯(lián)制備納米凝膠24等研究。本研究采用1，8萘酰亞胺熒光化合物N氨基4N甲基哌嗪1，8萘酰亞胺AMN對PAA進展接枝改性，制備了兩親性的熒光聚合物，并利用該聚合物在

5、水溶液中的自組裝得到了一種新的熒光納米粒子PAAMN； 對其形態(tài)、構(gòu)造及熒光特性進展了表征，并考察了其細胞毒性及細胞成像才能。結(jié)果說明，此納米粒子具有好的水溶性、光穩(wěn)定性和細胞相容性，可進入細胞并發(fā)射綠色熒光，在細胞成像方面有良好應(yīng)用前景。2 實驗部分2.1 儀器與試劑Bruker AV400型核磁共振儀瑞士Bruker公司； UV2550型紫外分光光度計日本島津公司； 320S型pH計梅特勒托利多儀器； F4600型熒光分光光度計日本日立高新技術(shù)公司； JEM100CXII型透射電鏡TEM日本電子株式會社； IX51型倒置熒光顯微鏡奧林巴斯株式會社； ST360型酶標(biāo)儀上?？迫A生物工程股份；

6、 Zetasizer Nano ZEN3600型動態(tài)光散射納米激光粒度儀英國Malvern公司。AMN的合成見文獻25； 聚丙烯酸PAA， 分子量2.6萬，河南凱特化工； Gibco胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基Invitrogen公司； 34，5二甲基噻唑22，5二苯基四氮唑溴鹽MTT，Sigma公司； HeLa細胞為實驗室傳代培養(yǎng)； 其它試劑均為市售分析純； 實驗用水為去離子水。2.2 PAAMN的制備將0.5 g PAA，0.63 g EDAC0鸋Cl和0.79 g NHS溶于10 mL DMF中，在室溫下攪拌反響1 h，向其中參加含AMN的DMF溶液，并于60攪拌反響4 h。將反響液離心，上

7、清液放入透析袋中，在pH 34的稀HCl中進展透析。透析一段時間后將袋內(nèi)膠狀固體取出，溶解在pH 11的NaOH溶液中，滴加稀HCl使其析出。經(jīng)過屢次堿溶酸沉處理后，將該固體溶解，再于水中透析，測試透析液熒光強度。當(dāng)透析液熒光強度為零時，將透析袋內(nèi)溶液取出， 凍干， 得目的產(chǎn)物PAAMN。2.3 PAAMN的形態(tài)及構(gòu)造表征將納米粒子溶液滴在含有Formar膜的銅網(wǎng)上，并進展負染，采用TEM觀察其形態(tài)； 采用納米激光粒度儀測定PAAMN在水溶液中的粒徑； 用DMSOd6+D2O為溶劑測定PAAMN的1H NMR光譜。將AMN溶于乙醇中，配成1.0 mg/mL儲藏液，再用水稀釋得所需濃度的工作溶液

8、。將PAAMN用水溶解， 配制成2.0 mg/mL儲藏溶液，并用水稀釋至所需濃度的工作溶液。分別測定AMN及PAAMN工作溶液的紫外可見吸收光譜； 在392 nm下測定不同濃度AMN溶液的吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)PAAMN溶液在392 nm處的吸光度和AMN的標(biāo)準(zhǔn)曲線，按文獻25的方法計算納米粒子中熒光團的摩爾取代度。2.4 熒光性質(zhì)研究熒光光譜及量子產(chǎn)率測定： 測定水溶液中PAAMN及AMN的熒光光譜； 以硫酸奎寧為參比，測定水溶液中PAAMN及AMN的熒光量子產(chǎn)率，硫酸奎寧在0.05 mol/L H2SO4溶液中的量子產(chǎn)率按0.55計算26。 光穩(wěn)定性考察： 以390 nm為激發(fā)波長，5

9、34 nm為發(fā)射波長，每隔5 s測定一次PAAMN溶液的熒光，觀察2.5 h內(nèi)熒光強度的變化。金屬離子對PAAMN熒光的影響： 分別移取PAAMN的工作溶液0.1 mL和Ph 7.4的磷酸鹽緩沖溶液5.0 mL參加到10.0 mL比色管中，再參加金屬離子； 以不加金屬離子的PAAMN體系作為對照。各溶液用水定容后測定熒光光譜，記錄熒光強度。pH值對PAAMN熒光的影響： 分別移取PAAMN及AMN的工作溶液0.1 mL參加到10.0 mL比色管中，用不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液定容后測定熒光光譜，記錄熒光強度。2.5 MTT法檢測細胞相容性參加含不同濃度PAAMN 的培養(yǎng)液， 置于培養(yǎng)箱中孵育2

10、4 h，此后向每孔參加20 L濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h。然后移去板內(nèi)液體，每孔參加200 L DMSO，將細胞培養(yǎng)板放置搖床上， 低速振蕩使結(jié)晶物充分溶解。 用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測量各孔的吸光度A。以未加PAAMN的細胞作空白對照，計算細胞的相對增殖率Relative growth rate，RGR： RGR = A實驗組/A空白對照組100%。2.6 納米粒子及染色細胞的熒光顯微成像納米粒子的熒光觀察： 將0.1 mg/mL PAAMN溶液用PBS溶液pH7.4稀釋10倍，然后取0.1 mL置于24孔培養(yǎng)板中，于熒光顯微鏡下觀察。細胞染色及成像： 將HeLa細

11、胞接種于24孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，移去原培養(yǎng)基，參加含0.01 mg/mL PAAMN的新培養(yǎng)基，并置于CO2培養(yǎng)箱中于37下培養(yǎng)2 h。然后移除培養(yǎng)基，用PBS溶液將細胞洗滌3次，再參加4%的多聚甲醛固定細胞，最后用熒光顯微鏡觀察細胞成像效果。3 結(jié)果與討論3.1 PAAMN的制備與表征PAAMN 的制備方法如圖1所示。PAA中的羧基被活化后與AMN中的氨基反響，形成接枝聚合物； 該聚合物在透析過程中發(fā)生自組裝形成納米粒子，未反響的熒光團和溶劑也在透析中除去。將透析純化后的納米粒子溶液凍干，得到PAAMN。固體PAAMN能溶解于水中形成黃色透明溶液。采用TEM、動態(tài)光散射DLS、UVVi

12、s 及1H NMR方法對納米粒子的形態(tài)及構(gòu)造進展了表征。TEMD如圖2A所示， 納米粒子呈規(guī)那么球狀顆粒； 如圖2B所示，DLS測定PAAMN的水合粒徑約為290 nm。圖3為AMN和PAAMN的UVVis光譜， AMN的最大吸收峰在392 nm，PAAMN的最大吸收峰在394 nm。1H NMR測定說明，PAAMN在7.008.77 ppm處有明顯的芳環(huán)氫相關(guān)信號，且在2.53.0 ppm處有哌嗪環(huán)上亞甲基的相關(guān)信號圖4。由于PAA在300 nm以上無明顯的吸收峰，其構(gòu)造中不存在芳環(huán)，而納米粒子中未與PAA鍵合的熒光團已通過透析除去，因此上述結(jié)果證明萘酰亞胺熒光團已經(jīng)被固定于PAAMN中。經(jīng)

13、計算，熒光團的摩爾取代度為4.1%，說明PAA中僅有部分羧基被取代，生成的納米粒子中仍有大量可修飾的羧基存在，為其進一步功能化提供了條件。3.2 熒光性質(zhì)由AMN和PAAMN的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜圖5可見，PAAMN具有與AMN類似的特征熒光光譜，它們的最大激發(fā)和發(fā)射波長均分別為390和534 nm，說明PAAMN的熒光是由萘酰亞胺熒光團產(chǎn)生，且與PAA鏈鍵合對熒光團的熒光波長無明顯影響。水溶液中PAAMN和AMN的量子產(chǎn)率測定結(jié)果分別是0.14和0.08，說明形成納米粒子增強了萘酰亞胺熒光團的熒光。在設(shè)定的測試條件下，2.5 h內(nèi)測定PAAMN的熒光強度變化在7%以內(nèi)圖6，說明其有較好的光穩(wěn)定

14、性。金屬離子對PAAMN熒光強度影響的實驗結(jié)果說明，在生理pH條件下，1.0106 mol/L的Mg2+，Hg2+，Ni2+，Mn2+，Al3+，Zn2+，Ba2+，Ag+和Cd2+對PAAMN的熒光沒有明顯影響ex=390 nm； em=534 nm.由于許多4氨基萘酰亞胺衍生物對pH敏感27，28，因此本研究進一步考察了pH值對PAAMN熒光性質(zhì)的影響。 結(jié)果說明，在pH 4.010.0范圍內(nèi)，PAAMN的最大激發(fā)和發(fā)射波長不隨pH值變化而變化，但熒光強度隨著pH值增大而逐漸減小。如圖7所示，PAAMN的這種pH調(diào)控?zé)晒夥肿娱_關(guān)功能與AMN類似，但熒光強度變化趨勢及范圍要小于AMN。造成上

15、述現(xiàn)象的原因可能是28，29： 堿性條件下，萘酰亞胺類化合物哌嗪基團中的烷基胺作為電子給體，向萘酰亞胺進展光致電子轉(zhuǎn)移PET，從而淬滅萘酰亞胺的熒光； 酸性增加使哌嗪基上的氮原子發(fā)生質(zhì)子化，抑制了PET過程，因此熒光強度增強； 與AMN相比，PAAMN中有較多的羧基，對哌嗪上氮原子的質(zhì)子化具有一定的緩沖作用，因此其熒光強度隨pH值變化相對較小。3.3 細胞相容性用于生物樣品的納米材料應(yīng)具有良好的生物相容性。細胞毒性試驗是體外評價納米材料生物相容性的常用方法，具有經(jīng)濟、快速、操作方便等優(yōu)勢。本實驗采用MTT法考察了PAAMN濃度0.0010.25 mg/mL對HeLa細胞增殖的影響，并根據(jù)美國藥

16、典中RGR與細胞毒性分級的關(guān)系RGR100%為0級； 80%99%為級； 50%79%為級； 30%49%為級； 029%，級對其毒性進展評級。從圖8可見，在測定的濃度范圍內(nèi)，當(dāng)PAAMN濃度低于0.1 mg/mL時，細胞的RGR均大于90%； 隨著PAAMN濃度增加，RGR略有下降，但都大于80%。各測試濃度PAAMN對HeLa細胞的毒性反響分級均為級，說明PAAMN具有良好的細胞相容性。 3.4 熒光成像PAAMN溶液的熒光顯微成像如圖9A所示，在390 nm激發(fā)光下，PAAMN能發(fā)射綠色的熒光。由于PAAMN具有好的細胞相容性，且在生理條件下具有較強的熒光，因此進一步考察了其用于細胞成像

17、的可行性。HeLa細胞在含0.01 mg/mL PAAMN的培養(yǎng)基中孵育，然后洗去多余的納米粒子，將細胞固定， 在390 nm激發(fā)光下觀察成像效果，結(jié)果如圖9B所示，染色后的細胞仍具有較好的形態(tài)， 發(fā)出綠色熒光，說明PAAMN在細胞成像方面具有應(yīng)用潛力。4 結(jié) 論本研究以具有良好生物相容性及水溶性的PAA聚合物為根底， 進展萘酰亞胺衍生物接枝改性，并將生成產(chǎn)物自組裝制備了球形的納米粒子。該納米粒子具有好的水溶性，熒光團以共價鍵的方式固定于其中，不易泄漏， 其在生理條件下具有較強的熒光，較長的熒光發(fā)射波長500 nm，大的Stocks位移144 nm以及良好的光穩(wěn)定性和細胞相容性。熒光顯微成像說

18、明，合成的熒光納米粒子能進入細胞，且在390 nm激發(fā)光下發(fā)射綠色熒光，可用于細胞熒光成像。由于具有大量可用于修飾的羧基，對其進展構(gòu)造修飾還有望制成高靈敏度和選擇性的熒光探針，在樣品檢測及生物成像研究中有應(yīng)用潛力。Reference1 Yao J， Yang M， Duan Y X. Chem. Rev.， 2022， 114： 6130-61782 Ng S M， Koneswaran M， Narayanaswamy R. RSC Adv.， 2022， 6： 21624-216613 Volkov Y. Biochem. Bioph. Res. Co.， 2022， 4683： 419-

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