中藥現(xiàn)代化之基因工程技術(shù) 第二章 1課件

基因工程技術(shù)及其在中藥現(xiàn)代化中的應(yīng)用主講人姚佳職稱(chēng)講師中藥現(xiàn)代化一、分子生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)二、基因工程原理三、植物基因工程四、DNA分子標(biāo)記在中藥鑒別中的應(yīng)用五、基因芯片技術(shù)與中藥研究本章主要內(nèi)容*2015/3/41第二章核酸第一章分子生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)

第一節(jié)核酸*2015/3/41第二章核酸：脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）核酸：由核苷酸通過(guò)磷酸二脂鍵連接而成的高聚物。核苷酸:是由戊糖的第一位碳上連接一個(gè)堿基，第5位碳上連接一個(gè)磷酸基團(tuán)所組成的基本單位，其中堿基和戊糖以糖苷鍵連接形成核苷第一節(jié)核酸*2015/3/41第二章RNA中的戊糖為D-核糖，堿基有A、G、T、UDNA中的戊糖為D-2-脫氧核糖，堿基有A、G、T、C*2015/3/41第二章第一節(jié)核酸DNA復(fù)性：變性的DNA經(jīng)過(guò)某種處理又重新形成天然DNA的過(guò)程，稱(chēng)為復(fù)性或退火。重新形成的DNA稱(chēng)為復(fù)性DNA。DNA雜交:復(fù)性的DNA分子不是由原來(lái)的兩條單鏈形成的，即復(fù)性是單鏈DNA隨機(jī)結(jié)合的過(guò)程。當(dāng)復(fù)性的DNA分子是由兩條不同源的單鏈分子形成時(shí)稱(chēng)為雜交DNA的性質(zhì)*2015/3/41第二章基因：是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位，根據(jù)是否具有轉(zhuǎn)錄及翻譯功能分為三類(lèi)第一類(lèi)編碼蛋白質(zhì)的基因第二類(lèi)只有轉(zhuǎn)錄功能而沒(méi)有翻譯的功能（tRNA和rRNA）第三類(lèi)不轉(zhuǎn)錄基因第二節(jié)基因*2015/3/41第二章基因表達(dá)：某些基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，經(jīng)過(guò)翻譯合成各種蛋白質(zhì)，這一過(guò)程稱(chēng)為基因表達(dá)?；虮磉_(dá)*2015/3/41第二章核酸分子雜交：是應(yīng)用核酸分子變性復(fù)性的性質(zhì)，使來(lái)源不同的DNA（或RNA）片段，按堿基互補(bǔ)關(guān)系形成雜交雙鏈分子的過(guò)程。在分子雜交中，若以識(shí)別靶DNA中的特異核苷酸序列為目的，就需要用到探針。第三節(jié)核酸分子雜交*2015/3/41第二章探針：是指以研究和診斷為目的，用來(lái)檢測(cè)特定核酸（DNA或RNA）的DNA或RNA片段。應(yīng)用前景廣闊，用于篩選目的基因、生物分類(lèi)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、基因連鎖分析等許多領(lǐng)域。第三節(jié)核酸分子雜交*2015/3/41第二章（一）材料的預(yù)處理1.潔凈目的：去除外源DNA的污染2.粉碎（二）提取方法1.CTAB法2.SDS法第四節(jié)植物細(xì)胞中DNA的提取*2015/3/41第二章（三）雜質(zhì)的去除1.去除多糖2.去除酚類(lèi)（四）DNA濃度和純度的檢測(cè)1.紫外分光光度法2.瓊脂糖凝膠法基因工程的誕生·1972年，美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家在體外進(jìn)行了DNA的改造試驗(yàn)，將SV40的DNA及λ噬菌體DNA分別切割，然后再將兩個(gè)物種的DNA連接起來(lái)，首次成功地進(jìn)行了DNA體外人工重組。1973年又將重組的DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌，第一次成功地進(jìn)行了無(wú)性繁殖，完成了DNA的體外重組和擴(kuò)增的全過(guò)程，基因工程由此誕生第二章基因工程的原理*1第二章特別是基因工程乙肝疫苗、基因工程α1型干擾素、促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素等都已應(yīng)用于臨床治療，更有一些基因工程新藥正在中試階段，但是基因工程技術(shù)在生產(chǎn)上經(jīng)濟(jì)效益還不大*2015/3/41第二章第二章基因工程的原理我國(guó)現(xiàn)在還缺乏具有生產(chǎn)意義的基因工程元件（目的基因）。我國(guó)目前還缺乏高效的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，需要努力構(gòu)建適用于不同宿主系統(tǒng)的高效表達(dá)載體系統(tǒng)基因合成技術(shù)的成熟發(fā)展，開(kāi)發(fā)基因資源是基因工程發(fā)展的基礎(chǔ)。第二章*4第二章基因工程的原理基因工程下游的重要步驟是表達(dá)后產(chǎn)物的分離、純化、及基因工程產(chǎn)物的后處理工藝。在表達(dá)產(chǎn)物的分泌機(jī)制的研究，分泌型載體受體系統(tǒng)的建立等方面，都有待于我們進(jìn)一步深入研究和開(kāi)發(fā)*2015/3/41第二章第二章基因工程的原理基因工程：也稱(chēng)基因操作、遺傳工程，或重組體DNA技術(shù)。是指某個(gè)基因通過(guò)載體運(yùn)送到另一種生物的活細(xì)胞內(nèi)，使該細(xì)胞進(jìn)行無(wú)性繁殖（克?。┘斑M(jìn)行正常功能（表達(dá)），而創(chuàng)造出新的生物品種或新的遺傳性狀。第一節(jié)

基因工程的概念*2015/3/41第二章具體操作：在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）與載體系統(tǒng)（病毒、細(xì)菌質(zhì)粒或噬菌體）的DNA結(jié)合，形成一個(gè)復(fù)制子。*5第二章第一節(jié)

基因工程的概念這樣形成的雜交分子可以在復(fù)制子所在的宿主細(xì)胞中復(fù)制，通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、生長(zhǎng)和篩選轉(zhuǎn)化子，無(wú)性繁殖成克隆。而后直接利用轉(zhuǎn)化子，或者將克隆的分子從轉(zhuǎn)化子中分離出來(lái)后，再導(dǎo)入其他的表達(dá)體系，使重組基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，最終產(chǎn)生特定基因產(chǎn)物*2015/3/41第二章第一節(jié)基因工程的概念植物基因工程方面，目前，人們已經(jīng)可以按意愿培育作物新品種，此舉有獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和開(kāi)發(fā)效益。但是也有可能對(duì)生物品種的多樣性、病蟲(chóng)害抗性、環(huán)境生態(tài)平衡和產(chǎn)品安全性等方面帶來(lái)潛在的或還沒(méi)有預(yù)測(cè)到的不良影響第二節(jié)

基因工程的安全性問(wèn)題*7第二章在動(dòng)物基因工程研究方面，科學(xué)家們利用高等細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)人用藥品，安全性研究顯得尤為突出第二節(jié)

基因工程的安全性問(wèn)題*2015/3/48第二章目的基因：是指準(zhǔn)備重組到受體細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的特定基因片段或DNA片段。為了得到這段“外源基因”，我們采取分離、純化、改造、擴(kuò)增等步驟而獲取目的基因制備方法：物理法、化學(xué)合成法、鳥(niǎo)槍無(wú)性繁殖法、酶促逆轉(zhuǎn)錄合成法第四節(jié)

制備目的基因的方法*2015/3/41第二章包括：密度梯度離心發(fā)，單鏈酶切發(fā)，分子雜交法密度梯度離心法：由于核酸DNA雙螺旋中堿基G與C配對(duì)，A與T配對(duì)，GC對(duì)較集中的片段密度較大，采用精密度比較高的密度梯度離心方法可以將被切割成適當(dāng)大小的DNA片段按密度大小不同分開(kāi)。在通過(guò)與放射性標(biāo)記的mRNA進(jìn)行雜交來(lái)確定要分離的目的基因片段。非洲爪蛙rDNA,5sDNA和海膽組蛋白基因就是采用這種方法分離得到的1物理化學(xué)法*2015/3/41第二章單鏈酶切法：堿基GC對(duì)之間有三個(gè)氫鍵，AT堿基對(duì)之間只有兩個(gè)氫鍵，所以GC對(duì)較穩(wěn)定。采用加熱或變性劑處理DNA時(shí)，雙鏈上AT配對(duì)較多的部位就先變性成單鏈，應(yīng)用單鏈特異的S1核酸內(nèi)切酶切除單鏈，再經(jīng)過(guò)超速離心，分離出沒(méi)有單鏈切口的DNA。最早海膽rDNA就是利用這種方法分離到的1物理化學(xué)法*2015/3/41第二章分子雜交法：?jiǎn)捂淒NA與其互補(bǔ)的堿基序列在適當(dāng)?shù)臈l件下，按“堿基互補(bǔ)配對(duì)”原則形成雙鏈，這就是核酸分子雜交的原理。利用核酸分子間可以進(jìn)行雜交的原理，非同源的DNA可以互補(bǔ)配對(duì)，DNA與RNA之間也可以配對(duì)，采用這種方法既能分離也能鑒定目的基因。果蠅18S、28SrDNA就是采用分子雜交的方法分離得到的1物理化學(xué)法*2015/3/41第二章主要包括磷酸二酯法磷酸三酯法固相磷酸三酯法2化學(xué)合成法*2015/3/41第二章鳥(niǎo)槍法：一種基于基因組提取目的基因的方法。首先利用物理方法（機(jī)械剪切、超聲波等）或酶切方法將生物細(xì)胞染色體的全部DNA切割成基因水平大小的片段，將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合成重組體，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，構(gòu)建成基因文庫(kù)，之后再結(jié)合篩選方法，從眾多轉(zhuǎn)化細(xì)胞中選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子，提取、分離、回收重組的DNA。3鳥(niǎo)槍無(wú)性繁殖法*2015/3/41第二章主要用于分子量較大而又不知道序列的基因它以目的基因的mRNA為模板，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成互補(bǔ)的cDNA。再在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈cDNA，與載體結(jié)合后轉(zhuǎn)入受體菌，擴(kuò)增為cDNA文庫(kù)，再?gòu)奈膸?kù)中篩選出目的基因4酶促逆轉(zhuǎn)錄合成法*2015/3/41第二章PCR也稱(chēng)無(wú)細(xì)胞克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法.5聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)*2015/3/41第二章具體操作：在適當(dāng)?shù)木彌_體系中加入模板雙鏈DNA（目的基因片段）、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、引物及四種dNTP按照模板的互補(bǔ)規(guī)則，從引物的5’到3’方向延伸，合成新的DNA鏈，使模板單鏈DNA重新復(fù)制成雙鏈。新的雙鏈DNA數(shù)量上應(yīng)該是開(kāi)始加入的模板DNA的兩倍，然后再開(kāi)始第二次循環(huán)擴(kuò)增，這樣雙鏈DNA的數(shù)量就以2的n次方是數(shù)量級(jí)增長(zhǎng)5聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)*2015/3/41第二章克隆即是獲得目的基因的重組體DNA的無(wú)性繁殖系，基因重組是目前基因克隆操作的核心內(nèi)容。基因重組就是在獲得目的基因后，再將其與經(jīng)過(guò)工具酶切割或修飾的載體DNA連接，目的基因隨著可自我復(fù)制的載體DNA一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，使外源目的基因可在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)。所以，首先要選擇適當(dāng)?shù)妮d體對(duì)其進(jìn)行修飾

第五節(jié)

基因載體的選擇與構(gòu)建*2015/3/41第二章載體基因的特性：1.在其中插入了目的基因的載體DNA能在受體細(xì)胞中獨(dú)立和穩(wěn)定地自我復(fù)制，且本身遺傳特性不變2.易于從宿主細(xì)胞中分離和純化出來(lái)3.在載體復(fù)制的非必需區(qū)，有限制酶切位點(diǎn)，最好是單一位點(diǎn)4.具有可檢測(cè)的表型特征第五節(jié)

基因載體的選擇與構(gòu)建*2015/3/41第二章細(xì)菌質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，他在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可以自主復(fù)制，并可遺傳給子代，但不是細(xì)胞生存必須的質(zhì)粒DNA分子呈共價(jià)雙鏈閉合環(huán)狀，自然旋轉(zhuǎn)成螺旋構(gòu)像，有時(shí)單鏈斷開(kāi)成為開(kāi)鏈環(huán)狀雙鏈斷開(kāi)成線(xiàn)型DNA1細(xì)菌質(zhì)粒載體*2015/3/41第二章根據(jù)質(zhì)粒復(fù)制與宿主菌的相關(guān)程度，將其分為嚴(yán)密型和松弛型兩種質(zhì)粒的抗藥基因在基因工程中應(yīng)用價(jià)值較高1細(xì)菌質(zhì)粒載體*2015/3/41第二章細(xì)菌質(zhì)粒載體攜帶外源基因只限于10kb以下的DNA片段，噬菌體作為載體可插入10kb-20kb或更大的DNA片段。λ噬菌體是一種溫和的噬菌體，在感染大腸桿菌時(shí)，呈現(xiàn)溶菌性和溶源性?xún)煞N生長(zhǎng)方式2噬菌體載體*2015/3/41第二章2.單鏈?zhǔn)删w載體是一種含有單鏈環(huán)狀DNA基因組的大腸桿菌特異噬菌體，基因長(zhǎng)度6-7kb3.粘性質(zhì)粒載體：是含有抗性基因、單一克隆位點(diǎn)以及λDNAcos位點(diǎn)的細(xì)菌質(zhì)粒。2噬菌體載體*2015/3/41第二章3動(dòng)物病毒載體*2015/3/41第二章酵母質(zhì)粒載體既可以在大腸桿菌中、又可以在酵母系統(tǒng)中進(jìn)行自我復(fù)制與擴(kuò)增。1.整合載體它帶有一個(gè)酵母URA3標(biāo)志基因和大腸桿菌的復(fù)制和報(bào)告基因2.自我復(fù)制載體該類(lèi)載體在酵母中可以自我復(fù)制3.釀酒酵母載體系統(tǒng)：在基因工程中，作為克隆宿主或作為調(diào)節(jié)表達(dá)序列的克隆載體其應(yīng)用廣泛4酵母質(zhì)粒載體*2015/3/41第二章是基因工程的核心步驟，即將目的基因與載體DNA連接的過(guò)程第六節(jié)

基因重組*2015/3/41第二章1.相同限制酶切位點(diǎn)的連接：由同一限制性核酸內(nèi)切酶切割不同DNA片段，具有完全相同的末端2.不同限制酶切位點(diǎn)的連接：由兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割的DNA片段，具有相同類(lèi)型的粘性末端，彼此稱(chēng)為配伍末端1粘性末端連接*2015/3/41第二章T4DNA連接酶可以催化相同或不同限制性核酸內(nèi)切酶切割的平端之間的連接，但是效率比粘性末端連接低2平端連接*2015/3/41第二章是人工合成的具有特定的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別和切割序列的雙股平端DNA寡序列，將其接在目的基因和載體DNA3人工接頭連接*2015/3/41第二章4同聚物加尾法*2015/3/41第二章重組DNA在受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，即外源基因的無(wú)性繁殖，