微生物的分類鑒定

地球上開始出現(xiàn)生命，主要是些類似簡單桿狀細菌的原始生物。大約46億年前，地球形成；大約35億年前，通過“前生命的化學(xué)進化”過程漫長的進化歷程千姿百態(tài)的生物種類第一頁，共五十五頁。形成于35億年前的微生物化石主要是些類似簡單桿狀細菌的原始生物形成于8.5億年前的微生物化石20億年前以后的巖石中的微生物的化石形態(tài)多樣性明顯增多第二頁，共五十五頁。形成于10億年前的微生物化石形態(tài)上非常類似于現(xiàn)代的藍細菌，進行不產(chǎn)氧光合作用的光能自養(yǎng)菌，及化能無機營養(yǎng)的硫細菌。形態(tài)上類似于現(xiàn)代的綠藻（真核生物）第三頁，共五十五頁。第四頁，共五十五頁。微生物分類學(xué)的基本任務(wù)：

對已知的大量的提煉出分類單元1、分類2、鑒定3、命名給新發(fā)現(xiàn)物種命名（一般用拉丁語）對未知的個別的進行鑒定，歸入分類系統(tǒng)第五頁，共五十五頁。一分類單元界（Kingdom）門（Phylum或Division）

綱（Class）

目（Order）

科（Family）

屬（Genus）

種（Species）

第一節(jié)通用分類單元

第六頁，共五十五頁。二種的概念

動物的種：凡兩個能互相交配產(chǎn)生具有有性生殖能力的物種。微生物的種：是最基本的分類單元，它是表型特征高度相似，親緣關(guān)系極其相近，與同屬內(nèi)的其它種有著明顯差異的菌株的總稱。

菌株（Strain）：任何由一個獨立分離的單細胞繁殖而成的純種的種群（純培養(yǎng)物）及其一切后代。

模式菌株（種）：是被指定的代表一個種的菌株，該菌株具有此種的各個典型形狀，即具體的種。

第七頁，共五十五頁。BacillussubtilisASI.398BacillussubtilisBF7658生產(chǎn)蛋白酶生產(chǎn)α淀粉酶第八頁，共五十五頁。第九頁，共五十五頁。三學(xué)名

屬名：在前，一般用拉丁文名詞表示，字首字母大寫，表示形態(tài)、構(gòu)造等主要特征。

種名：在后，常用拉丁文形容詞表示，全部小寫，表示來源、寄主、顏色等次要特征。若所分離的菌株只鑒定到屬，而未鑒定到種，可用sp來表示，例如Bacillussp.（spp.）1、雙名法

學(xué)名＝屬名＋種加詞＋（首次定名人）＋現(xiàn)定名人＋定名年份

斜體正體（一般省略）

第十頁，共五十五頁。2、三名法

命名一亞種或變種時用三名法。

學(xué)名＝屬名＋種加詞＋符號Subsp或Var＋亞種或變種的加詞

斜體正體（可?。┬斌w

亞種（subspecies，subsp，ssp.）：進細一步的分類單元，一般指除某一明顯而穩(wěn)定的特征外，其余鑒定特征與模式種相同的種。

變種（Variety，Var）：亞種的同義詞，現(xiàn)已不用。型（Form）：菌株的同義詞，現(xiàn)已廢除。第十一頁，共五十五頁。四微生物在生物界中的分類地位1、界級分類1753年，二界：動物界、植物界*；1860年，三界：動物界、植物界、原始生物界*；

1956年，四界：動物界、植物界、原始生物界*（原生動物、真菌、藻類）、菌界*（細菌、藍細菌）；第十二頁，共五十五頁。1949年，六界：后生動物界、后生植物界、原生生物界*、真菌界*、原核生物界*、病毒界*；

1977年，王大耜

六界：在五界基礎(chǔ)上加一病毒界*；1996年，六界：動物界、植物界、原生生物界*、真菌界*、真細菌界*、古細菌界*。1969年，五界：動物界、植物界、原生生物界*、真菌界*、原核生物界*；第十三頁，共五十五頁。2、三域?qū)W說（三原界系統(tǒng)）細菌域（真細菌原界）、古細菌域（古細菌原界）、真核生物域（真核生物原界）古細菌特點：1）細胞壁缺乏常規(guī)肽聚糖成分；2）細胞壁類脂成份特殊；3）16srRNA核苷酸序列特殊；4）tRNA成份特殊，無T；5）Pr合成的起始密碼特殊：甲硫氨酸（與真核生物同）；6）生態(tài)條件特殊。

第十四頁，共五十五頁。五各大微生物的分類系統(tǒng)1、細菌細菌、放線菌等原核微生物的分類系統(tǒng)很多，目前較有代表性和最有影響的分類系統(tǒng)是美國的《伯杰氏細菌學(xué)鑒定手冊》(Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology

，簡稱“手冊”)1923年第一版以來，相繼于1925、1930、1934、1939、1948、1957、1974和1994年出版了第二版至第九版第十五頁，共五十五頁。2000年，Bergey’sManualofSystematicBacteriology第二版編輯完成并分成5卷陸續(xù)出版。在此第二版中，細菌域分為16門，26組，27綱，62目，163科，814屬，收集了4727個種。古菌域分為2門，5組，8綱，11目，17科，63屬，收集了208個種。供收集進原核微生物4935個種。在1984～1989年間，“手冊”的出版者出版了《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》(Bergey’sManualofSystematicBacteriology，簡稱“系統(tǒng)分類學(xué)手冊”)與“手冊”有很大不同：首先是在各級分類單元中廣泛采用細胞化學(xué)分析、數(shù)值分類方法和核酸技術(shù)，尤其是16SrRNA寡核苷酸序列分析技術(shù)，以闡明細菌的親緣關(guān)系，并對第八版手冊的分類作了必要的調(diào)整。第十六頁，共五十五頁。2、菌物（真菌）

1995年，《安·貝氏菌物詞典》，第八版。第十七頁，共五十五頁。第二節(jié)微生物的分類鑒定一經(jīng)典指標1、個體細胞形態(tài)、大小、排列方式，染色反應(yīng)，有無運動，各種特殊構(gòu)造特征等2、形態(tài)特征菌落形態(tài)，在固體、半固體或液體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)等第十八頁，共五十五頁。3、營養(yǎng)要求碳源、氮源、礦質(zhì)元素、生長因子等4、生理生化特征代謝產(chǎn)物種類、產(chǎn)量、顯色反應(yīng)等產(chǎn)酶種類和反應(yīng)特征等5、酶第十九頁，共五十五頁。生理生化特征在以實用為主要目的表型分類中，生理生化特征往往是細菌分類鑒定的主要特征。腸道菌科細菌屬和種的分類鑒定就是如此。能否發(fā)酵乳糖能否以檸檬酸為唯一碳源產(chǎn)生賴氨酸、脫羧酶志賀氏菌屬產(chǎn)生硫化氫沙門氏菌屬是否產(chǎn)生3-羥基丁酮檸檬酸桿菌屬埃希氏桿菌屬腸桿菌屬第二十頁，共五十五頁。6、生態(tài)學(xué)特性生長溫度，對氧的需要，酸堿度要求，宿主種類，生態(tài)分布等7、血清學(xué)反應(yīng)8、噬菌體的敏感性第二十一頁，共五十五頁。形態(tài)和生理生化特征是最常用的細菌分類、鑒定指標第二十二頁，共五十五頁。在現(xiàn)代微生物分類中，任何能穩(wěn)定地反映微生物種類特征的資料，都有分類學(xué)意義，都可以作為分類鑒定的依據(jù)。形態(tài)學(xué)特征、生理學(xué)特征、生態(tài)學(xué)特征從不同層次(細胞的、分子的)，用不同學(xué)科(化學(xué)、物理學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等)的技術(shù)方法來研究和比較不同微生物的細胞、細胞組分或代謝產(chǎn)物，從中發(fā)現(xiàn)的反映微生物類群特征的資料。生物分類的傳統(tǒng)指標：第二十三頁，共五十五頁。二現(xiàn)代指標

（一）遺傳學(xué)指標1、DNA中G+Cmol%分析1）每個生物種都有特定的G+C%范圍，因此可以作為分類鑒定的指標。細菌的GC%范圍為25--75%，變化范圍最大，因此更適合于細菌的分類鑒定。第二十四頁，共五十五頁。第二十五頁，共五十五頁。2）GC%測定主要用于對表型特征難區(qū)分的細菌作出鑒定，并可檢驗表型特征分類的合理性，從分子水平上判斷物種的親緣關(guān)系。3）使用原則：G+C含量的比較主要用于分類鑒定中的否定每一種生物都有一定的堿基組成，親緣關(guān)系近的生物，它們應(yīng)該具有相似的G+C含量，若不同生物之間G+C含量差別大表明它們關(guān)系遠。但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它們之間具有近的親緣關(guān)系。第二十六頁，共五十五頁。同一個種內(nèi)的不同菌株G+C含量差別應(yīng)在4～5%以下；同屬不同種的差別應(yīng)低于10～15%；若二個在形態(tài)及生理生化特性方面極其相似的菌株，如果其G+C含量的差別大于5%，則肯定不是同一個種，大于15%則肯定不是同一個屬。第二十七頁，共五十五頁。①

80年代以前螺菌屬(Spirillum)不同種的G+C含量范圍寬達38～66%，后來“伯杰氏手冊”(1984)結(jié)合其他特征已將其分成三個屬：螺菌屬、海洋螺菌屬(Oceanospirillum)和水螺菌屬(Aquaspirillum)它們G+C含量分別為38%、42～51%和49～66%；②過去根據(jù)形態(tài)學(xué)特征曾認為微球菌屬(Micrococcus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)是關(guān)系很近的兩個屬，因而長期放在一個科內(nèi)，由于G+C含量的差異(分別為30～38%和64～75%)表明它們親緣關(guān)系相當(dāng)遠，現(xiàn)在根據(jù)16SrRNA序列資料已進行新的調(diào)整。第二十八頁，共五十五頁。在疑難菌株鑒定、新種命名、建立一個新的分類單位時，G+C含量是一項重要的，必不可少的鑒定指標。其分類學(xué)意義主要是作為建立新分類單元的一項基本特征和把那些G+C含量差別大的種類排除出某一分類單元。G+C含量的比較主要用于分類鑒定中的否定第二十九頁，共五十五頁。2、核酸的分子雜交不同生物DNA堿基排列順序的異同直接反映生物之間親緣關(guān)系的遠近，堿基排列順序差異越小，它們之間的親緣關(guān)系就越近，反之亦然。直接分析比較DNA的堿基排列順序------由于技術(shù)上的困難目前尚難以普遍地進行；核酸分子雜交(hybridization)間接比較不同微生物DNA堿基排列順序的相似性第三十頁，共五十五頁。1）DNA-DNA雜交；（親緣關(guān)系相對近的微生物之間的親緣關(guān)系比較）2）DNA-rRNA雜交；（親緣關(guān)系相對遠的微生物之間的親緣關(guān)系比較）3）核酸探針；（利用特異性的探針，用于細菌等的快速鑒定）第三十一頁，共五十五頁。第三十二頁，共五十五頁。第三十三頁，共五十五頁。特異性的探針主要用于病原微生物的快速鑒定第三十四頁，共五十五頁。3、電子雜交隨著微生物基因信息，特別是全基因組完全測序的不斷增加，我們可以通過各種計算機軟件對不同物種的遺傳信息進行直接比較，從而分析不同微生物間的親緣關(guān)系。第三十五頁，共五十五頁。蛋白質(zhì)、RNA和DNA序列進化變化的顯著特點是進化速率相對恒定，也就是說，分子序列進化的改變量(氨基酸或核苷酸替換數(shù)或替換百分率)與分子進化的時間成正比。4、16SrRNA編目分析

a）在兩群生物中，如果同一種分子的序列差異很大時，------------進化距離遠，進化過程中很早就分支了。b）如果兩群生物同一來源的大分子的序列基本相同，------------處在同一進化水平上。第三十六頁，共五十五頁。16SrRNA被普遍公認為是一把好的譜系分析的“分子尺”：1）rRNA具有重要且恒定的生理功能；2）在16SrRNA分子中，有高度保守、中度保守和高度變化序列區(qū)域，因而它適用于進化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究；3）16SrRNA分子量大小適中，便于序列分析；4）rRNA在細胞中含量大(約占細胞中RNA的90%)，也易于提??；5）16SrRNA普遍存在于真核生物(同源分子是18SrRNA)和原核生物中。因此它可以作為測量各類生物進化的工具。4、16SrRNA編目分析

第三十七頁，共五十五頁。核糖體RNA第三十八頁，共五十五頁。第三十九頁，共五十五頁。利用16SrRNA建立分子進化樹的美國科學(xué)家

CarlWoese

第四十頁，共五十五頁。rRNA和系統(tǒng)發(fā)育樹1.rRNA的順序和進化培養(yǎng)微生物提取并純化rRNArRNA序列測定分析比較微生物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（從cDNA序列得出）第四十一頁，共五十五頁。用反轉(zhuǎn)錄酶和雙脫氧測序法對微生

物培養(yǎng)物進行測序的步驟用PCR法進行rRNA測序第四十二頁，共五十五頁。a代表16SrRNA的全長c系統(tǒng)發(fā)育樹b進化距離，即任意兩個生物RNAs間非同源序列的比例第四十三頁，共五十五頁。2.特征序列或序列印記（signaturesequence）通過對rRNA全序列資料的分析比較（特別是采用計算機）發(fā)現(xiàn)的在不同種群水平上的特異特征性寡核苷酸序列，或在某些特定的序列位點上出現(xiàn)的單堿基印記。特征序列有助于迅速確定某種微生物的分類歸屬，或建立新的分類單位。第四十四頁，共五十五頁。定義3種生物領(lǐng)域的16S或18SrRNA的序列特征第四十五頁，共五十五頁。3.系統(tǒng)發(fā)育樹(phylogenetictree)通過比較生物大分子序列差異的數(shù)值構(gòu)建的系統(tǒng)樹稱為分子系統(tǒng)樹，其特點是用一種樹狀分枝的圖型來概括各種(類)生物之間的親緣關(guān)系。圖型中，分枝的末端和分枝的連結(jié)點稱為結(jié)(node)，代表生物類群，分枝末端的結(jié)代表仍生存的種類。系統(tǒng)樹可能有時間比例，或者用兩個結(jié)之間的分枝長度變化來表示分子序列的差異數(shù)值。第四十六頁，共五