總RNA提取-常用方案

總RNA提取--常用方案總RNA提取--常用方案總RNA提取--常用方案資料僅供參考文件編號：2022年4月總RNA提取--常用方案版本號：A修改號：1頁次：1.0審核：批準(zhǔn):發(fā)布日期：試劑盒快速提取實驗方法原理GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯(lián)合使用，將促使核蛋白復(fù)合體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。而進一步從復(fù)合體中純化RNA，則根據(jù)Chomczynski和Sacchi的一步快速抽提法進行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚將使RNA進入水相，這樣使其與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分離。水相中的RNA可用異丙醇沉淀濃縮。進一步將上述RNA沉淀復(fù)溶于GTC溶液中，接著用異丙醇進行二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所有殘留的蛋白質(zhì)和無機鹽，而RNA中如含無機鹽，則有可能對以后操作中的一些酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制。實驗材料微生物動物細胞植物組織試劑、試劑盒RNA提取試劑盒焦碳酸二乙酯乙醇儀器、耗材恒溫水浴冷凍高速離心機紫外分光光度計取液器電泳儀電泳槽實驗步驟一、細胞或組織破碎

1.

微生物材料

（1）發(fā)酵3~4天（或?qū)?shù)生長期）的菌體，離心收集菌絲體（動植物材料無需此步處理）。

（2）用經(jīng)DEPC處理的水洗菌絲體2~3次，并盡量除去殘存的水。

（3）加液氮充分研磨，使其成為粉末，以釋放RNA。

（4）研磨后的樣品轉(zhuǎn)移至12ml變性液的容器中勻漿。

2.

動植物細胞培養(yǎng)材料（適用的樣品量為細胞：108）

（1）細胞或組織培養(yǎng)：按常規(guī)方法進行。

（2）深層懸浮培養(yǎng)細胞的破碎。

①細胞收集：含一定濃度的細胞培養(yǎng)液置于無菌離心管中，4℃，3000g離心5分鐘。

②細胞洗滌：上步沉淀用25ml滅菌后冰凍的1×PBS緩沖液洗滌，然后4℃，3000g離心5分鐘。

③細胞破碎：在沉淀細胞中加入15ml預(yù)冷的變性液，用無菌處理過的勻漿器勻漿。

3.

表面培養(yǎng)細胞的破碎

（1）確定培養(yǎng)瓶數(shù)量，使選定的各培養(yǎng)瓶細胞累加后總量達108。

（2）細胞收集：將培養(yǎng)液倒掉，用預(yù)冷的無菌PBS緩沖液洗滌一次，在培養(yǎng)瓶中加入8ml預(yù)冷變性液。

（3）轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，使細胞溶解，此時可見粘度加大。

（4）用無菌吸管將第一個培養(yǎng)瓶中的液體吸入第二個培養(yǎng)瓶，旋轉(zhuǎn)，溶解細胞，再吸入第三個培養(yǎng)瓶，以此類推。

（5）直到將所選定的培養(yǎng)瓶全部洗滌一次，然后從第一個培養(yǎng)瓶開始再加入4毫升上述變性液，將所有培養(yǎng)瓶洗一次。

（6）將上述12ml含細胞的變性液轉(zhuǎn)移至一50ml無菌離心管中，勻漿破碎細胞。

4.

植物組織破碎（適用的樣品量為g組織）

（1）將600ul變性液置于ml離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。

（2）將g新鮮組織用液氮冰凍。

（3）在液氮下，研磨組織塊。

（4）待液氮揮發(fā)后，將上述分散的組織轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。

5.

動物組織破碎（適用的樣品量為1g組織）

（1）將12

ml變性液置于50

ml離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。

（2）在上述管中加入1g新鮮或冰凍動物組織，勻漿粉碎。

二、RNA的抽提

1.

在經(jīng)變性液勻漿的細胞或組織600ul+60ul的2M乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器。

2.

600ul酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。

3.

冰裕中10~15分鐘，離心，4℃，10000g，20分鐘。

4.

上層水相吸至無菌離心管中加等體積的異丙醇，-70℃，30分鐘沉淀RNA。

5.

離心4℃，10000g，20分鐘。

6.

沉淀RNA，冷凍干燥15分鐘，RNA沉淀重新溶于300ul變性液中，可振蕩（有時為了幫助溶解，可在65℃加熱，但時間應(yīng)極短）。

7.

60ul的2M乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器。

8.

600ul酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。

9.

冰裕中10~15分鐘，離心，4℃，10000g，20分鐘。

10.

上層水相吸至無菌離心管中。

11.

等體積異丙醇二次沉淀（-70℃，30分鐘），75%乙醇洗沉淀，沉淀冷凍干燥。

12.

復(fù)溶于去RNA酶的水中（對于準(zhǔn)備長期保存的RNA可加入pH的乙酸鈉至終濃度為M，再加入體積的乙醇，-70℃保存。）。展開

注意事項1.

研磨組織塊用于RNA提取的樣品，必須是新鮮的細胞或組織，如采樣后，不能立即用于提取則樣品應(yīng)用液氮速凍并貯于-70℃的冰箱中保存。

2.

變性液及相應(yīng)的離心管需預(yù)冷。其他1.

變性液組成

25g異硫氰酸胍溶于33mlCSB(42mM乙酸鈉、%十二烷基肌氨酸鈉、mMβ-巰基乙醇)，65℃溶解，過濾滅菌，4℃預(yù)冷。

2.

酸性酚配制

55℃時，500g酚溶入500ml50mM，乙酸鈉，混勻，靜止分層后，去上清，再反復(fù)加500ml50mM，乙酸鈉，直到pH<。氯化鋰提取法實驗方法原理用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA，具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高，小RNA片斷丟失的缺陷。實驗材料微生物動物細胞植物組織試劑、試劑盒氯化鋰尿素Tris-HCLEDTASDS儀器、耗材恒溫水浴冷凍高速離心機紫外分光光度計取液器電泳儀電泳槽實驗步驟一、組織或細胞勻漿

1.

對于大量組織或細胞，則每克組織或細胞加入5~10ml氯化鋰-尿素溶液，勻漿器高速勻漿2分鐘。

2.

對于少量細胞（107個細胞/ml），則每克組織或細胞加入ml氯化鋰—尿素溶液手工勻漿，并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中。

二、純化

1.

勻槳液在0~4℃放置4小時后，12000g離心30分鐘。

2.

取沉淀，加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰—尿素溶液，重復(fù)步驟1。

3.

沉淀用原勻漿液1/2體積的氯化鋰—尿素溶液復(fù)溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置15~30分鐘并不時搖動混勻，4000g離心5分鐘。

4.

取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（）及2倍體積的乙醇，-20℃放置1小時，5000g離心。

5.

70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥。

6.

RNA溶解液溶解沉淀，得RNA。

三、保存

分裝，于-70℃保存。一步法實驗材料RNA試劑、試劑盒乙酸鈉氯仿異戊醇異丙醇乙醇SDS酚儀器、耗材離心機分光光度計搖床實驗步驟1.

組織來源材料：100ng組織加1μl變性液，在玻璃Teflon勻漿器中將其勻漿。

2.

培養(yǎng)細胞：離心棄懸浮細胞培養(yǎng)液或倒去單層培養(yǎng)細胞培養(yǎng)液（不需用生理鹽水洗滌），每107細胞加入1ml變性液，然后用吸管抽吸7~10次。

3.

將勻漿移入5ml聚丙烯管子，加入體積的2mol/l的乙酸鈉緩沖液，混勻。

4.

加入1ml水飽和酚，混勻；再加入體積的49：1氯仿/異戊醇。

5.

混勻后0~4℃放置15min。

6.

于4℃用SS-34轉(zhuǎn)子10000g離心20min，將上層水相移入一個干凈試管中。

7.

加入1ml（等體積）異丙醇-20℃放置30min沉淀RNA，于4℃10000g離心10min。

8.

將RNA溶解于ml變性液，并移入1.5ml微量離心管中，加ml異丙醇,。

9.

-20℃放置30min沉淀，于4℃10000g離心10min。

10.

重懸RNA沉淀于75%乙醇，旋起沉淀，室溫放置10~15min，10000g離心5min。

11.

真空干燥RNA5~10min，溶解沉淀于100~200μlDECP此處理過的水或DEPC處理過的%SDS，-70℃冰凍保存或保存在-20℃的乙醇中。CsCl法實驗材料RNA試劑、試劑盒PBS異硫氰酸胍CsClDEPC無水乙醇儀器、耗材注射器電泳儀離心機培養(yǎng)箱實驗步驟一、用于單層培養(yǎng)細胞

1.

室溫下用PBS冼滌細胞，每平皿用5ml，洗2次。

2.

在不超過108細胞中加入異硫氰酸胍溶液，并使之遍布整個平皿。

3.