植物組織培養(yǎng)第三章植物器官和組織培養(yǎng)

關(guān)于植物組織培養(yǎng)第三章植物器官和組織培養(yǎng)第1頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五組織培養(yǎng)步驟圖第2頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（1）準(zhǔn)備階段

查閱相關(guān)文獻，根據(jù)已成功培養(yǎng)的相近植物資料，結(jié)合實際制定出切實可行的培養(yǎng)方案。根據(jù)實驗方案配制適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)消毒劑以及不同培養(yǎng)階段所需的培養(yǎng)基，并經(jīng)高壓滅菌或過濾除菌后備用。（2）外植體的選擇與消毒

選擇合適的部位作為外植體，采回后經(jīng)過處理，然后進行消毒處理。將消毒后的外植體在無菌條件下切割成一定大小的小塊，或剝離出莖尖、挑出花藥，接種到啟動培養(yǎng)基上。第3頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（3）啟動培養(yǎng)

接種后的材料置于培養(yǎng)室或光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，促使外植體中已分化的細(xì)胞脫分化形成愈傷組織，或頂芽、腋芽直接萌發(fā)形成芽。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基分化成不同的器官原基或形成胚狀體，最后發(fā)育形成再生植株。（4）增殖培養(yǎng)

分化形成的芽、原球莖數(shù)量有限，采用適當(dāng)?shù)脑鲋撑囵B(yǎng)基經(jīng)反復(fù)多次切割轉(zhuǎn)接。當(dāng)芽苗繁殖到一定數(shù)量后，再將一部分用于壯苗生根，另一部分保存或繼續(xù)擴繁。進行脫毒苗培養(yǎng)的還要進行病毒檢測。

第4頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（5）生根培養(yǎng)剛形成的芽苗往往比較弱小，多數(shù)無根，此時可降低或不加細(xì)胞分裂素濃度，提高生長素濃度，促進芽苗生根，提高其健壯度。（6）煉苗移栽選擇生長健壯，有3～5條根的生根苗進行煉苗，移栽到疏松透氣的基質(zhì)中，注意保溫、保濕、遮蔭。當(dāng)苗完全成活后，再移向大田。第5頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五擬定培養(yǎng)方案外植體預(yù)處理外植體無菌接種啟動培養(yǎng)分化出芽、胚狀體或原球莖繼代增殖培養(yǎng)生根培養(yǎng)煉苗移栽成活供生產(chǎn)使用植物組織培養(yǎng)的一般程序

培養(yǎng)基配制滅菌第6頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五第一節(jié)植物器官和組織培養(yǎng)的基本程序無菌外植體的獲得初代培養(yǎng)物的建立形態(tài)發(fā)生和植株再生培養(yǎng)產(chǎn)物的觀察記載第7頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五無菌外植體的獲得（一）莖尖、莖段、葉片的滅菌清水沖洗，吸干—0.1-0.2%氯化汞浸泡2-10min，（70%酒精浸泡數(shù)秒，10%次氯酸鈣浸泡10-20min或2%次氯酸鈉浸泡15-30min）—滅菌水沖洗3-5次—無菌濾紙吸干—分割—接種。（二）根、塊莖、鱗莖的滅菌生長在土中，滅菌困難，以受損傷。滅菌前仔細(xì)清洗，加大滅菌劑濃度或延長滅菌時間。第8頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五無菌外植體的獲得（三）花蕾的滅菌未開放的花蕾中的花藥為花被包裹，處于無菌狀態(tài)，采摘后可直接滅菌。70%酒精浸泡10-30s—0.1-0.2%氯化汞浸泡3-10min，（或1%次氯酸鈉浸泡10-20min）—滅菌水沖洗3-5次—無菌濾紙吸干—分割—接種。（四）果實和種子的滅菌

表皮有茸毛或蠟質(zhì)，需在滅菌劑中加入幾滴土溫-80。果實70%酒精浸泡數(shù)秒—0.1-0.2%氯化汞浸泡3-10min，（或1%次氯酸鈉浸泡10-20min）—滅菌水沖洗3-5次—無菌濾紙吸干—分割—接種。第9頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五初代培養(yǎng)物的建立（一）無菌環(huán)境培養(yǎng)基、接種器械、超凈工作臺、接種室環(huán)境、抗生素物質(zhì)（去除侵入組織內(nèi)部的病菌。見表）（二）規(guī)范操作操作技術(shù)熟練、工作經(jīng)驗、操作者、進入超凈工作臺的物品表面。（三）條件合適培養(yǎng)基種類、激素種類和濃度、其他添加物、外植體來源、生長發(fā)育狀態(tài)、培養(yǎng)條件。第10頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五形態(tài)發(fā)生和植株再生建立的無菌培養(yǎng)物在適宜的離體環(huán)境中，生長發(fā)育（形態(tài)發(fā)生）形成完整的小植株。離體材料的形態(tài)發(fā)生的途徑：器官發(fā)生體細(xì)胞胚胎發(fā)生第11頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五形態(tài)發(fā)生和植株再生器官發(fā)生：芽或芽原基起源于培養(yǎng)組織中比較表層的細(xì)胞，即外起源。根原基發(fā)生在組織較深處，即內(nèi)起源。兩者之間一般沒有什么聯(lián)系，呈現(xiàn)單向極性。胚狀體發(fā)生：極大多數(shù)體細(xì)胞胚起源于單細(xì)胞，形成的胚狀體具有雙極性，在其發(fā)育的早期階段，在方向相反的兩端分化出莖端和根端，其維管組織與母體植物或外植體的維管組織通常沒有聯(lián)系。胚狀體維管組織呈獨立的Y形。第12頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五

外植體形態(tài)發(fā)生形成完整植株的途徑（一）外植體-愈傷組織-完整植株。具體又可分為三種：1、愈傷組織-同時長芽和根-植株。2、愈傷組織-莖-根-植株。3、愈傷組織-根-芽-植株。4、愈傷組織-體細(xì)胞胚-植株第13頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（二）外植體-胚狀體-植株。可從以下幾種培養(yǎng)物中產(chǎn)生：1、器官上發(fā)生。2、愈傷組織上發(fā)生。3、游離單細(xì)胞發(fā)生。4、小孢子發(fā)生。誘導(dǎo)胚狀體比誘導(dǎo)芽數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整。（三）外植體-直接形成根與芽-植株。如莖尖培養(yǎng)第14頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五第15頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五培養(yǎng)產(chǎn)物的觀察與記載（一）愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%生長量=培養(yǎng)一段時間后愈傷組織干重或鮮重-接種時愈傷組織的干重或鮮重（二）胚狀體胚狀體誘導(dǎo)率=產(chǎn)生胚狀體的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%（三）芽芽分化數(shù)=產(chǎn)生芽的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%（四）根發(fā)根率=發(fā)根芽數(shù)/培養(yǎng)芽數(shù)每個材料平均發(fā)根數(shù)第16頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五第二節(jié)植物營養(yǎng)器官培養(yǎng)植物根段培養(yǎng)植物莖段培養(yǎng)植物葉培養(yǎng)第17頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五一、離體根的培養(yǎng)

植物根段培養(yǎng)是指以植物的根切段為外植體進行培養(yǎng)的技術(shù)。（一）根無性系的建立來自無菌種子發(fā)芽產(chǎn)生的幼根切段或植物根系經(jīng)滅菌處理后的切段，可以以兩種方式進行培養(yǎng)，建立根的無性繁殖系。

第18頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五1、根的直接增殖1）根無性繁殖系的建立將種子進行表面消毒，在無菌條件下進行無菌萌發(fā)，待根伸長后從根尖一段切取長1.0cm的根尖，接種培養(yǎng)基中。這些根的培養(yǎng)生長很快，番茄根每天約生長10mm，幾天后發(fā)育出側(cè)根。待側(cè)根生長約一周后，即可切取側(cè)根的根尖進行擴大培養(yǎng)，它們又迅速生長出側(cè)根，又可切下進行培養(yǎng)，如此反復(fù)，就可得到從單個根尖衍生而來的離體根的無性系。

2）培養(yǎng)條件：黑暗培養(yǎng)，溫度為25—27℃一、離體根的培養(yǎng)

第19頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五3）培養(yǎng)基離體根培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基很多，多為無機離子濃度低的White培養(yǎng)基，其他培養(yǎng)基如MS、B5培養(yǎng)基等也可采用，但必須將其離子濃度稀釋到2/3或1/2。一、離體根的培養(yǎng)

第20頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五一、離體根的培養(yǎng)

4）培養(yǎng)方式離體根的培養(yǎng)方式有三種類型。第一種固體培養(yǎng)法，即將根尖接種在固體培養(yǎng)基上，根依靠培養(yǎng)基中的養(yǎng)分和生長物質(zhì)而不斷生長。第二種是液體培養(yǎng)法，把根尖接種在無瓊脂的液體培養(yǎng)基中，經(jīng)常振蕩使根獲得充足的氧氣。第三種是固體-液體培養(yǎng)法，就是把根基部插入固體瓊脂培養(yǎng)基中，根尖浸在液體培養(yǎng)基中，根尖生長而根不斷的伸長和分枝。第21頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五2、根的間接增殖第一步在脫分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織，如胡楊的根段培養(yǎng)，可誘導(dǎo)形成白色愈傷組織。第二步在再分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成芽的分化，如胡楊從綠色愈傷組織分化出小植株。一、離體根的培養(yǎng)

第22頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五胡蘿卜根培養(yǎng)第23頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（二）離體根生長的營養(yǎng)要求1、無機成分要求培養(yǎng)基中有全部必要元素，因為它是離體生長所需要的，一般的為MS、B5培養(yǎng)基。2、氮源氮源有銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和可溶性有機氮如氨基酸或酰胺等，其中以硝態(tài)氮的效果最好。加入含各種氨基酸的水解酪蛋白，能促進離體根的生長。一、離體根的培養(yǎng)

第24頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五3、碳源以蔗糖的效果最佳，幾乎為葡萄糖的10倍。蔗糖的濃度為2—3%。4、維生素維生素以B1和B6最為重要，缺少它根的生長受到阻礙，而加入它可使根的生長成倍的加快。B1的使用濃度為0.1-1.0mg/L為宜。5、生長物質(zhì)對離體根的生長而言，生長素的效應(yīng)最為明顯，在一般情況，加入適量的生長素能促進根的生長，其反應(yīng)和需要量因植物種而異：6、溫度和光照黑暗有利于根的形成，溫度一般在16-25℃7、PH根發(fā)生和生長所需的PH范圍一般為5.0-6.0一、離體根的培養(yǎng)

第25頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五二、莖段培養(yǎng)莖段培養(yǎng)是指對植物的帶有一個以上定芽或不定芽的外植體（包括塊莖、球莖、鱗莖等在內(nèi)的幼莖切段）的無菌培養(yǎng)。目的:1、快速繁殖，2、探討莖細(xì)胞的分裂潛力和全能性，以及誘發(fā)細(xì)胞變異，篩選突變體。我們主要是介紹用于快速繁殖為目的的莖段培養(yǎng)。第26頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五莖段

莖尖取材有限，可采用帶節(jié)或不定牙的莖段進行培養(yǎng)。第27頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五莖段培養(yǎng)用于快速繁殖的優(yōu)點培養(yǎng)技術(shù)簡單易行，繁殖速度較快，每年可增殖105-1012株苗；加速良種和珍貴植物的繁殖，芽生芽方式增殖的苗木質(zhì)量好，且無病，性狀均一；解決不能用種子繁殖的無性繁殖植物的快速繁殖的問題，且可節(jié)省種株；試管苗便于運輸和防止種苗帶菌傳播，有利于國際種質(zhì)交流；試管苗可用于保存某些難以用種子保存的種質(zhì)資源。第28頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五Murashige(1974)曾提出用組織培養(yǎng)法進行植物快速繁殖三個階段的概念，第一階段——外植體成苗；第二階段——繁殖體增殖；第三階段——移植于土壤中長根。這三個階段對于不同植物來說有不同的反應(yīng)，應(yīng)用于草本植物是成功的，但對木本植物來說，最大的困難是第三個階段。第29頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五1、無菌苗的建立目的：從所取用的外植體誘發(fā)芽的形成，以獲得無菌苗?？赡苡兴姆N不同結(jié)果：一是得到單生芽，二是得到叢生芽：細(xì)胞分裂素水平高時三是得到長根的完整植株。四是得到愈傷組織：生長素水平較高時作為快速繁殖而言，我們希望屬于第一、第二結(jié)果，它有利于提高繁殖系數(shù)，加速繁殖速度。第30頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五2、無菌苗的增殖⑴增殖的途徑一是誘導(dǎo)形成大量的胚狀體二是誘導(dǎo)形成大量的不定芽三是促進腋芽的快速形成。第31頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五2、無菌苗的增殖優(yōu)缺點：第一、二種途徑的好處是增殖速度快，但會產(chǎn)生變異，第三種途徑的好處是不會產(chǎn)生變異，能保持品種優(yōu)良特性，且方法簡便，可在各種植物上使用，但增殖速度不如前二者。若用于育種，以第一、第二種途徑有利，而用于良種快速增殖，以第三種途徑有利，主要是要保證良種的優(yōu)良品性，不產(chǎn)生變異。目前已廣泛采用，每年每個芽可增殖10萬株乃至上百萬株。第32頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五⑵腋芽增殖的原理

高等植物的每個葉腋中都有腋芽存在，通常由于頂芽的存在，頂端優(yōu)勢阻止腋芽的生長，但在一定的條件下可以使它生長，如除去頂芽或使用生長激素，可以解除頂端優(yōu)勢，腋芽便不斷分化和生長，逐漸形成芽叢。若反復(fù)切割這些腋芽和移植到新的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，就可在短期內(nèi)得到大量的芽。第33頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五⑶影響增殖成功的關(guān)鍵因素A、細(xì)胞分裂素在腋芽增殖上的主要措施是用細(xì)胞分裂素抑制頂端優(yōu)勢，促進腋芽生長發(fā)育，所以在這一階段培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素是必須的。實踐證實，除個別的例子外，加入細(xì)胞分裂素是行之有效的。6-BA對促進腋芽增殖是最有效，依次為KIN和2ip。一般濃度在0.25mg/l以上，少數(shù)用1.0mg/L，個別的用5mg/L。第34頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五B、生長素

生長素雖不能促進腋芽增殖，但可改善苗的生長，因此，許多種植物也都加入一定的生長素類物質(zhì)。其中使用最多的是NAA，依次為IBA、IAA和2，4-D，它們的使用濃度多為0.5mg/L以下。⑶影響成功的關(guān)鍵因素第35頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五C、GA

GA對芽的伸長有促進作用，故常加入少量的GA，使用濃度為0.5mg/L。

D、光照光照條件也十分重要，這一階段必須保持適當(dāng)?shù)墓庵芷?16小時光照)和光強(2000-3000Lux)，以利芽的再生和生長。⑶影響成功的關(guān)鍵因素第36頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五3、無菌苗的生根這個階段的目的是使再生的大量試管苗形成根系，獲得完整的植株，在前兩階段以長苗為目的，使用的生長激素往往不利于生根的發(fā)生和生長，因此在這個階段，必須創(chuàng)造一個適于根的發(fā)生和生長的條件。主要是降低或除去細(xì)胞分裂素，而加入或增加生長素。第37頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五影響生根成功的關(guān)鍵因素①培養(yǎng)基的鹽濃度試管苗的生根，對基本培養(yǎng)基的種類要求不嚴(yán)，一般的培養(yǎng)基都可用于誘導(dǎo)生根，但對其含鹽濃度要適量加以稀釋。前面的幾種培養(yǎng)基中，除White培養(yǎng)基外，都富含N、P、K鹽，它們都抑制根的發(fā)生。因此，應(yīng)將它們降低到1/2、1/3或1/4，甚至更低的水平。就可得到理想的生根結(jié)果。第38頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五②生長素的濃度

細(xì)胞分裂素同生長素的比值大于1時，有利于芽的產(chǎn)生和生長；比值小于1時，則有利于根的產(chǎn)生和生長。由于在苗增殖時施用了較高濃度的細(xì)胞分裂素，其苗中尚保持著一定的量，因此在生根培養(yǎng)時一般不需要添加細(xì)胞分裂素，或者仍使用較低濃度的細(xì)胞分裂素，如降低到0.02mg/L以下。生長素是必須的，且需要較高的濃度。使用的生長素類物質(zhì)最多的是NAA，依次為IBA、IAA、2，4-D。生長素的濃度，NAA一般是0.1-1.0mg/l不等。IBA和IAA可稍高些。第39頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五③光照和溫度條件

增強光照有利于發(fā)根，且對成功地移栽到盆缽中有良好作用，故在生根培養(yǎng)時應(yīng)增加光照時間和光照強度。但強光直接照射根部會抑制根的生長，所以在生根培養(yǎng)基時最好在培養(yǎng)基中加入0.3%的活性碳，可促進生長。第40頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五4、試管苗的移植

1）盆土的準(zhǔn)備土最好是經(jīng)過干熱滅菌、高溫高壓滅菌，或者用福爾馬林（5%）或（0.3%）硫酸銅稀釋液噴灑在土壤中，然后用塑料布覆蓋一周，在翻動土，讓其溶液氣味揮發(fā)掉。為了有利于試管苗根系的發(fā)育，要求移栽土疏松，因此與1/2—1/3的草木灰混合起來作為移植的介質(zhì)。也可以用山土和腐熟過的木屑或其它通氣良好的介質(zhì)。第41頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五2）遮蔭和加熱設(shè)備的準(zhǔn)備試管苗在冬天或夏天移栽時，最初的幾天里要注意溫度與日照的變化不能有急劇的變化，溫度最好與培養(yǎng)室的溫度一致或接近。光也不能直射，主要因為植株的根系還未得到重新發(fā)育。夏天溫度過高，造成植株萎蔫，冬天溫度太低導(dǎo)致植株死亡。第42頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五3）煉苗將試管苗容器口的塞子或紙去掉，并在培養(yǎng)室中放置1天。從培養(yǎng)室移至常溫條件下放置幾天，要注意不要染菌。第43頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五4）移栽將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，小心操作，勿把根系損壞。然后洗凈根部的培養(yǎng)基。在盆土中開一穴，將植株栽下，最好將根鋪展開，種植不要過深，也不能過淺，不要用手用力壓土，以免造成根系的損傷。第44頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五5、移栽后管理①土壤要保持疏松，通氣要好，這樣有利于根系的發(fā)育。②水分的控制要得當(dāng)，移栽后第一次澆水要澆透，且勿出現(xiàn)上濕下干現(xiàn)象。第一次澆水最好采用滲水的方式，即將剛移栽的盆放在裝有水的盆中，讓水從盆底逐漸滲上來，水在盆面出現(xiàn)既可。平時要勤觀察，保持土壤濕潤。③濕度控制要適當(dāng)大一些，對試管苗的恢復(fù)發(fā)育和根系的形成有好處。因而要在盆口用玻璃器皿或塑料布罩上。這樣有利于保證濕度，但是也要注意通風(fēng)，防止發(fā)霉而事得其反第45頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五④溫度夏天要讓試管苗在陰涼的地方進行過渡，冬天要在溫室中過渡一段時間，以免溫度過高或過低導(dǎo)致試管苗的死亡。⑤光照剛移栽的試管苗且勿在陽光下。⑥注意天氣變化，試管苗應(yīng)移栽在無風(fēng)的地方，移栽初期應(yīng)避免大的風(fēng)雨的襲擊。第46頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五三、離體葉的培養(yǎng)離體葉培養(yǎng)是指包括葉原基、葉柄、葉鞘、葉片、子葉在內(nèi)的葉組織的無菌培養(yǎng)。再生植株的方式有兩種：一種是直接誘導(dǎo)形成芽或胚狀體，另一種是先誘導(dǎo)形成愈傷組織，再經(jīng)愈傷組織分化成植株。葉培養(yǎng)的結(jié)果：芽或胚狀體；愈傷組織；成熟葉第47頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五第48頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五葉的離體培養(yǎng)技術(shù)

1、材料滅菌取干凈幼嫩的葉，用70%酒精漂洗10秒鐘，再在飽和漂白粉中浸8—15分鐘，用無菌水沖洗數(shù)次，再把葉子夾放在無菌干濾紙上吸干水份，供接種用。注意粗糙的或帶絨毛的葉較難除菌，應(yīng)在消毒液中加入一滴吐溫(一種表面活化劑)，時間應(yīng)適當(dāng)?shù)难娱L。第49頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五2、接種把消毒過的葉組織切成約0.2cm2小塊或薄片，接種在MS培養(yǎng)基或其它常用的培養(yǎng)基中，附加足夠量的生長素(如2，4-D2mg/L)或細(xì)胞分裂素(如0.2mg/L6-BA)。第50頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五3、培養(yǎng)葉接種物應(yīng)放在25℃，每天10小時的光照，光強約1500—2000LUX的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)約經(jīng)兩周至月余，葉切口乃至切塊開始增厚腫大，進而形成愈傷組織。這時應(yīng)轉(zhuǎn)移到含細(xì)胞分裂素約2mg/L的再分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，約經(jīng)10天愈傷組織開始轉(zhuǎn)綠，因而出現(xiàn)綠色芽點，它們將發(fā)育成苗。若在分化培養(yǎng)基上不長根，還需將苗移至NAA0.5mg/L的生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，從而發(fā)育成完整的植株。第51頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五葉片愈傷組織誘導(dǎo)形成第52頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五4、培養(yǎng)中應(yīng)注意的問題

首先要選用易培養(yǎng)成功的葉組織，如幼嫩葉比成熟葉易培養(yǎng)，子葉比葉片易于培養(yǎng)。其次要添加適當(dāng)種類和數(shù)量的生長激素，葉的培養(yǎng)比胚、莖尖、莖段培養(yǎng)難度大，因此生長激素的選用是十分重要的，往往以多種生長素或多種細(xì)胞分裂素的配合使用，較有利于葉組織的脫分化和再分化。如水稻葉片單用2，4-D效果差，而2，4-D、NAA、IAA等三種生長素以4:2:1(mg/L)的比例配合使用，有利于愈傷組織形成。第53頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五第三節(jié)植物繁殖器官培養(yǎng)植物花器官培養(yǎng)植物幼果培養(yǎng)植物種子培養(yǎng)第54頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五植物花器官培養(yǎng)植物的花器官培養(yǎng)：對植物的整朵花或花的組成部分（花托、花柄、花瓣、花絲、子房、花藥、胚珠等）進行離體培養(yǎng)的技術(shù)。將未開放的花蕾、花柄、花瓣、花托等組織經(jīng)過滅菌處理或適當(dāng)切割后，在適宜條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果可能有：成熟果實、不定芽或叢生芽、愈傷組織

第55頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五植物幼果培養(yǎng)植物幼果培養(yǎng)：對植物不同發(fā)育時期的幼小果實進行離體培養(yǎng)的技術(shù)。經(jīng)過滅菌處理后，在適宜條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果可能有：成熟果實、愈傷組織

第56頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五植物種子培養(yǎng)植物種子培養(yǎng)：對受精后發(fā)育不全的未成熟種子和發(fā)育完全的成熟種子實進行離體培養(yǎng)的技術(shù)。經(jīng)過滅菌處理后，在適宜條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果可能有：小植株、愈傷組織、叢生芽或不定芽。對糖濃度要求一般較低，為1-3%。

第57頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五第四節(jié)植物組織培養(yǎng)植物分生組織培養(yǎng)植物愈傷組織培養(yǎng)植物薄層組織培養(yǎng)第58頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五

植物分生組織培養(yǎng)是指對植物的分生組織進行離體培養(yǎng)的技術(shù)，包括植物根尖、莖尖等頂端分生組織和形成層組織的培養(yǎng)。莖尖培養(yǎng)：對植物頂端的原分生組織和它衍生的分生組織的培養(yǎng)。莖尖組織經(jīng)過適當(dāng)培養(yǎng)后，可能發(fā)育的方向為：芽萌發(fā)、產(chǎn)生胚狀體、產(chǎn)生不定器官、形成愈傷組織。植物分生組織的培養(yǎng)第59頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五植物愈傷組織培養(yǎng)植物愈傷組織培養(yǎng)：誘導(dǎo)植物外植體產(chǎn)生無序生長的薄壁細(xì)胞及對其培養(yǎng)的技術(shù)。植物的各種器官及組織，經(jīng)培養(yǎng)都可產(chǎn)生愈傷組織，并能不斷繼代繁殖。一般薄壁細(xì)胞和形成層容易形成愈傷組織，愈傷組織的質(zhì)地差異很大，有的緊密堅實，有的疏松柔軟。第60頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五植物愈傷組織培養(yǎng)致密堅實的愈傷組織內(nèi)無大的細(xì)胞間隙，由管狀分子組成維管組織；疏松柔軟的愈傷組織有大量的大細(xì)胞間隙，細(xì)胞排列無序。兩種質(zhì)地的愈傷組織可以利用生長素進行轉(zhuǎn)換，即高濃度生長素變致密堅實愈傷組織為疏松柔軟。愈傷組織通常在黑暗或弱光下進行，溫度為25℃第61頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五莖尖分生組織培養(yǎng)莖尖分生組織培養(yǎng)僅指長度不超過0.1mm莖尖的頂端圓錐區(qū)的培養(yǎng)，這么小的外植體是不易培養(yǎng)成功的，因此只有在用于某些植物獲得無病原體的植物才采用，而一般都采用較大的帶一個和幾個葉原基的莖尖培養(yǎng)。第62頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五能得到無病毒的植株的主要原因是：病毒侵染植株后，通過胞間連絲轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞中，或依靠篩管進行轉(zhuǎn)移。因此，病毒在患病植株上的分布是不均勻的，即老的成熟器官中病毒含量高，幼嫩未成熟的器官中病毒含量較低而莖尖分生組織，在細(xì)胞沒有充分分化以前不受侵染，故幾乎不帶病毒。

第63頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五1、培養(yǎng)技術(shù)①莖尖組織的分離從未發(fā)病植株上，取正在生長的頂芽、萌發(fā)芽和球莖的中心芽。材料用70%的酒精浸沒幾秒到數(shù)十秒鐘，再在稀釋20倍的次氯酸鈉中浸5—10分鐘，用無菌水沖洗數(shù)次后，供組織分離用。第64頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五在無菌條件下進行無菌操作，把芽放在解剖鏡下，用鑷子、刀子、解剖針等工具，逐層把芽外面的幼葉和葉原基除去，使生長點露出，這時要細(xì)心，不要弄傷頂端圓錐體，用利刃切下含有1—2個葉原基的0.1-0.2mm長的生長點，然后接種到瓊脂培養(yǎng)基上，切取生長點的大小，是培養(yǎng)能否取得成功的關(guān)鍵，原則是在生長點不帶病毒的情況下，盡量取稍大些的生長點，這樣易于培養(yǎng)成功。

第65頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五②培養(yǎng)：常用的培養(yǎng)基有White(1943)，Morel(1995)，MS培養(yǎng)基等等。2，4-D，IAA，NAA等生長素是必須的，它們能有效地促進芽的生長發(fā)育，但是濃度并能太高，一般用0.1mg/l左右即可，高于1.0mg/L，往往產(chǎn)生畸變芽或形成愈傷組織。接種后的生長點，在培養(yǎng)基上生長很慢，再生植株往往需要幾個月甚至一年以上。因此，注意滿足其培養(yǎng)條件是十分重要的。生長點培養(yǎng)要求24—27℃的溫度，最好給以日夜溫差，適當(dāng)?shù)墓庵芷诤凸?。由于培養(yǎng)時間長，應(yīng)注意培養(yǎng)基保濕，一般可用防濕的鋁箔或塑料薄膜包裹解決。

第66頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五莖尖經(jīng)過適當(dāng)培養(yǎng)后，可能發(fā)育的方向為：

芽萌發(fā)；產(chǎn)生胚狀體；產(chǎn)生不定器官；形成愈傷組織第67頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五③脫毒試管苗植物的移植Ⅰ嫁接—扦插法把試管苗剪下，先嫁接在砧(zhen)木上，然后再扦插成活，最后長成植株。Ⅱ移植法當(dāng)試管苗長到數(shù)厘米和形成較多的根系時，打開試管蓋，放在室內(nèi)窗口處煉苗2—3天。然后小心取出苗，洗去根上的瓊脂以免滋生細(xì)菌，再移栽至小花盆中。第68頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五病毒植物的鑒定

第69頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（一）指示植物(indmatingplant)法

利用病毒在其他植物上產(chǎn)生的枯斑作為鑒別病毒種類的方法，就是枯斑和空斑的測定法。這種專門選用以產(chǎn)生局部病斑的寄主即為指示植物，又稱鑒別寄主。它只能鑒定靠汁液傳染的病毒。最早是美國的病毒學(xué)家Holmes1929年發(fā)現(xiàn)的。他用感染TMV的昔通煙葉的粗汁液和少許金剛砂相混合，然后在煙葉子上摩擦2—3d后葉片止出現(xiàn)了局部壞死斑。在一定范圍內(nèi)，枯斑與侵染性病毒的濃度成正比。這種方法條件簡單，操作方便，故一直沿用至今，仍為一種經(jīng)濟而有效的鑒定方法?？莅叻ú荒軠y出病毒總的核蛋白濃度，而只能測出病毒的相對感染力。第70頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（二）抗血清(antisemm)鑒定法

用已知抗血清可以鑒定未知病毒的種類。這種抗血清就是高度專一性的試劑，這種方法特異性高，測定速度快，一般幾小時甚至幾分鐘就可以完成。所以抗血清法成為植物病毒鑒定中最有用的方法之一。

第71頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五由于人的眼睛難以觀察小于0.1mm的微粒，而借助于普通光學(xué)顯微鏡也只能看到小至200bm的微粒，所以只有通過電子顯微鏡才能分辨0.5μm大小的病毒顆粒。這樣采用電子顯微鏡既可以直接觀察病毒，檢查出有無病毒存在，了解病毒顆粒的大小、形狀和結(jié)構(gòu)，又可以鑒定病毒的種類。這是一種較為先進的方法，但需一定的設(shè)備和技術(shù)。

這一方法的優(yōu)點是靈敏度高和能在植物粗提取液中定量測定病毒。（三）電子顯微鏡(elecmcmicroscope)檢查法第72頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五酶聯(lián)免疫法是指采用酶標(biāo)記抗原或抗體的定量測定法。將抗原固定在支持物上，加入待檢血清，然后加入酶(過氧化物酶或堿性磷酸酶)標(biāo)記的抗體，使待檢血清中與對應(yīng)抗原的特異性抗體結(jié)合，最后用特殊分光光度計測定。此法是現(xiàn)在靈敏度較高和常使用的方法。

（四）酶聯(lián)免疫鑒定法第73頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五第74頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五一、無病毒苗的保存繁殖無病毒植株并不是有額外的抗病性，它們有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到無病毒苗，就應(yīng)很好地隔離與保存。

無病毒植物的利用第75頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五二、無病毒苗的利用

無病毒苗在生產(chǎn)中的利用也要防止病毒的再感染。生產(chǎn)場所應(yīng)隔離病毒感染途徑，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此種植區(qū)及種植規(guī)模小的地方，要較長時間才會感染。而在種植時間長、輪作及種植規(guī)模大的產(chǎn)地則在短期內(nèi)就可以感染。一旦感染，便會影響產(chǎn)量和質(zhì)量的保證。因此，應(yīng)重新采用無病毒苗，以保證生產(chǎn)的質(zhì)量。第76頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五三、無病毒苗的效果無病毒苗可以表現(xiàn)出明顯的優(yōu)良效果。如草莓可增產(chǎn)20%—50%，植株結(jié)果多，單果重增加，上等果比例提高。菊花切花品種的脫毒株，表現(xiàn)出株高增加，切花數(shù)增多，花朵大，切花較重等特點。

第77頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（一）污染的原因及其預(yù)防措施1、污染原因污染是指在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。病原菌：細(xì)菌及真菌兩大類。三、培養(yǎng)中常見問題第78頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五⑴細(xì)菌污染特點-菌斑呈黏液狀，接種后1-2天發(fā)現(xiàn)。污染途徑：外植體帶菌培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底操作人員未遵守操作規(guī)程

⑵真菌污染的特點-污染部分長有不同顏色的霉菌，接種后3-10天發(fā)現(xiàn)。污染途徑：周圍環(huán)境不清潔超凈工作臺過濾裝置失效培養(yǎng)瓶的口徑過大第79頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五2、污染的預(yù)防措施⑴防止材料帶菌的措施-莖尖作外植體時，進行預(yù)培養(yǎng)（無糖）或暗培養(yǎng)。無糖營養(yǎng)液或自來水使枝條抽枝，以新抽嫩枝作外植體。-晴天取材，下午取材，經(jīng)日曬過可殺死部分細(xì)菌或真菌。-接種時除去外部韌皮組織，只接內(nèi)部的分生組織。第80頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（2）外植體的滅菌-多次滅菌法，次氯酸鈉-無菌水-次氯酸鈉-多種藥液交替浸泡法，肥皂水-酒精-次氯酸鈉-無菌水。第81頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五⑶器皿與金屬器械的滅菌玻璃器皿可采用濕熱滅菌或干熱滅菌金屬器皿一般火焰滅菌，也可干熱滅菌⑷布質(zhì)制品的滅菌濕熱滅菌⑸無菌操作室的滅菌

2%新捷爾滅或70%酒精擦拭（噴霧），紫外燈照射，定期甲醛和高錳酸鉀熏蒸。⑹嚴(yán)格按照操作程序。第82頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（二）外植體的褐變及其防止措施。1、褐變的原因褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞內(nèi)的酚類物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類物質(zhì)，這種致死的褐變物向外擴散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，抑制其它酶的活性，影響外植體的分化，最后變褐死亡的現(xiàn)象。

第83頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五⑴基因型某些植物酚類物質(zhì)含量較多。⑵外植體的生理狀態(tài)幼年的材料培養(yǎng)含醌類物質(zhì)較少。⑶培養(yǎng)基的成分-過高的無機鹽濃度-生長調(diào)節(jié)物質(zhì)使用不當(dāng)，BA過多-分生能力強的材料，氧化受抑制，褐變也被抑制-培養(yǎng)條件不適宜，溫度過高或光照過強，褐變加速。⑷材料轉(zhuǎn)移時間時間過長引起材料褐變。第84頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五2、褐變的防止措施⑴選擇適宜的外植體及最佳培養(yǎng)基。⑵連續(xù)轉(zhuǎn)移。⑶加抗氧化物。⑷加活性炭。0.1-0.5%活性炭

第85頁，共98頁，2022年，5月20日，2點9分，星期五（三）玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施1、玻璃化現(xiàn)象及其產(chǎn)生原因玻璃化是在細(xì)胞生長過程中的環(huán)境產(chǎn)生變化，試管苗為了適應(yīng)變化了的環(huán)境而呈玻璃狀。主要原因是：⑴激素濃度BA濃度提高，導(dǎo)致玻璃化苗的產(chǎn)生。⑵瓊脂濃度瓊脂濃度低，玻璃化苗增加。第86頁，共98頁，2022年，5月20