siRNA與癌癥治療的探究

siRNA與癌癥治療的探究siRNA的簡(jiǎn)介

小干擾RNA（SmallinterferingRNA；siRNA）有時(shí)稱為短干擾RNA（shortinterferingRNA）或沉默RNA（silencingRNA），是長度20到25個(gè)核苷酸的雙股RNA，在生物學(xué)上有許多不同的用途。目前已知siRNA主要參與RNA干擾（RNAi）現(xiàn)象，以帶有專一性的方式調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。此外，也參與一些與RNAi（RNAinterference核糖核酸干擾）相關(guān)的反應(yīng)途徑，例如抗病毒機(jī)制或是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變、阻斷細(xì)胞內(nèi)可能發(fā)生的有害活動(dòng)，如腫瘤細(xì)胞的生長，但是要成功地將siRNA傳送到特異性的細(xì)胞中而不對(duì)其它細(xì)胞產(chǎn)生不利影響還一直是個(gè)難題。本次siRNA的結(jié)構(gòu)siRNA通常是一段長21個(gè)核苷酸的雙股RNA（dsRNA），其兩股分別在RNA的兩端超出另一端2個(gè)核苷酸，圖示如下：

每一股各有一個(gè)5'磷酸基末端與一個(gè)3'羥基末端。此結(jié)構(gòu)經(jīng)dicer作用而得，dicer是RNaseIII家族中特異識(shí)別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)。

此外，siRNA也可經(jīng)由多種不同轉(zhuǎn)染（transfection）技術(shù)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并對(duì)特定基因產(chǎn)生具專一性的基因敲除（knockdown）效果。本質(zhì)上，任何已知序列的基因都可以、也因此是經(jīng)過適當(dāng)剪裁而具有序列互補(bǔ)性的siRNA的作用對(duì)象。這使siRNA成為研究基因功能與藥物目標(biāo)的一項(xiàng)重要工具。siRNA與癌癥治療的探究RNAi

RNA沉默是存在于生物中的一種古老現(xiàn)象,是生物抵抗異常DNA(病毒、轉(zhuǎn)座因子和某些高重復(fù)的基因組序列)的保護(hù)機(jī)制,同時(shí)在生物發(fā)育過程中扮演著基因表達(dá)調(diào)控的角色，它可以通過降解RNA、抑制翻譯或修飾染色體等方式發(fā)揮作用，因此在治療癌癥腫瘤中有很大的應(yīng)用前景。siRNA與癌癥治療的探究siRNA發(fā)揮RNAi作用的過程

siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA激活的RISC

通過堿基配對(duì)定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3’端12個(gè)堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機(jī)制尚不明了，但每個(gè)RISC都包含一個(gè)siRNA和一個(gè)不同于Dicer的RNA酶。

另外，還有研究證明含有啟動(dòng)子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化,從而使啟動(dòng)子失去功能,使其下游基因沉默。siRNA與癌癥治療的探究歸納siRNA的特點(diǎn)

依賴Dicer酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點(diǎn)。

2長度約在22nt左右。1是RISC組分。4生成需要Argonaute家族蛋白存在3植物體內(nèi)也存在內(nèi)源的siRNA。5siRNA在RNAi應(yīng)用中的缺陷

在RNAi實(shí)驗(yàn)中，化學(xué)合成與體外轉(zhuǎn)錄方法都是在體外得到siRNA后再導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，但是這兩種方法主要有兩方面無法克服的缺點(diǎn)：siRNA進(jìn)入細(xì)胞后容易被降解；進(jìn)入細(xì)胞siRNA在細(xì)胞內(nèi)的RNAi效應(yīng)持續(xù)時(shí)間短。針對(duì)這種情況，出現(xiàn)了質(zhì)粒、病毒類載體介導(dǎo)的siRNA體內(nèi)表達(dá)。該方法的基本思路是：將siRNA對(duì)應(yīng)的DNA雙鏈模板序列克隆入載體的RNA聚合酶III的啟動(dòng)子后，這樣就能在體內(nèi)表達(dá)所需的siRNA分子。這種方法總體的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作RNA，能達(dá)到較長時(shí)間的基因沉默效果。質(zhì)粒表達(dá)siRNA的優(yōu)點(diǎn)

通過質(zhì)粒表達(dá)siRNAs大都是用PolIII啟動(dòng)子啟動(dòng)編碼shRNA(smallhairpinRNA)的序列。選用PolIII啟動(dòng)子的原因在于這個(gè)啟動(dòng)子總是在離啟動(dòng)子一個(gè)固定距離的位置開始轉(zhuǎn)錄合成RNA，遇到4—5個(gè)連續(xù)的U即終止，非常精確。當(dāng)這種帶有PolIII啟動(dòng)子和shRNA模板序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，這種能表達(dá)siRNA的質(zhì)粒確實(shí)能夠下調(diào)特定基因的表達(dá)，可抑制外源基因和內(nèi)源基因。采用質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)在于，通過siRNA表達(dá)質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，siRNA載體能夠更長時(shí)間地抑制目的基因表達(dá)。當(dāng)然還有一點(diǎn)，那就是由于質(zhì)粒可以復(fù)制擴(kuò)增，相比起其它合成方法來說，這就能夠顯著降低制備siRNA的成本。

此外，帶有抗生素標(biāo)記的siRNA表達(dá)載體可用于長期抑制研究，通過抗性輔助篩選，該質(zhì)?？梢栽诩?xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)數(shù)星期甚至更久（比如Clontech（現(xiàn)屬于Takara）的RNAi-Ready表達(dá)載體）。另外帶有熒光標(biāo)記的siRNA表達(dá)載體也受到研究者的重視與歡迎，因?yàn)閹晒鈽?biāo)記的表達(dá)載體，可以讓研究人員通過熒光標(biāo)記很容易觀察到載體的轉(zhuǎn)染效率及目的基因的沉默效率?？赏ㄟ^熒光顯微鏡觀察含有\(zhòng)shRNA的細(xì)胞或通過流式細(xì)胞儀富集被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。同時(shí)熒光蛋白的表達(dá)與shRNA的表達(dá)是獨(dú)立的，因此不影響shRNA基因沉默的效果。帶有標(biāo)記的siRNA表達(dá)載體研究人員將編碼人類端粒酶RNA（humantelomeraseRNA，hTR），長67bp的寡核苷酸引入pSIREN——一種重組腺病毒構(gòu)建中的穿梭載體。然后將U6-RNA啟動(dòng)子和siRNA編碼insert從pSIREN上剪切下來，亞克隆進(jìn)pAdeno-X，構(gòu)建出了質(zhì)粒pAd-hTR。接著研究人員將pAd-hTR轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系HEK-293，獲得了攜帶有hTR靶向的siRNA（Ad-hTR-siRNA）的腺病毒。通過一系列的實(shí)驗(yàn)，研究人員證明了Ad-hTR-siRNA介導(dǎo)的端粒酶沉默在HeLa細(xì)胞中的作用。同時(shí)將Ad-hTR-siRNA與Ad-NT-siRNA進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)前者能極大的降低HeLa細(xì)胞中hTRmRNA水平（by70.21%），和端粒酶活性（by58.87%）。而且會(huì)引起HeLa細(xì)胞凋亡。利用Ad-hTR-siRNA進(jìn)行皮下腫瘤異種移植治療可以減緩腫瘤的生長，其中至少部分是由于體內(nèi)細(xì)胞凋亡（P<0.05）?？偠灾?，這些研究結(jié)果證明了hTRsiRNA在HeLa細(xì)胞系中有效和特異的端粒酶的敲除，從而指出了這種siRNA表達(dá)重組腺病毒系統(tǒng)在癌癥基因治療方面的前景。siRNA病毒載體減緩腫瘤生長siRNA在卵巢癌治療中的實(shí)驗(yàn)探究siRNA在胃癌治療中的實(shí)驗(yàn)探究siRNA與癌癥的實(shí)驗(yàn)siRNA在其他癌癥治療中的應(yīng)用siRNA與癌癥治療的探究

德克薩斯州學(xué)M.D.Anderson癌癥中心的項(xiàng)新研究顯示，裝載在一微小的脂肪球中的一種分子開關(guān)（siRNA）能夠滲入卵巢癌腫瘤細(xì)胞中“掐死”一種討厭的蛋白并明顯縮小腫瘤的尺寸。該項(xiàng)研究的結(jié)果刊登在8月15日的ClinicalCancerResearch雜志上，這項(xiàng)研究還成為該期雜志的封面故事。

小鼠模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)一種強(qiáng)有力的短干擾RNA（siRNA）傳遞系統(tǒng)能夠攻擊癌癥。SiRNA是一種能用于沉默基因關(guān)閉有害蛋白制造的偉大技術(shù)。在離體實(shí)驗(yàn)中，這種技術(shù)的效果很好，但是難點(diǎn)是如何能夠讓它進(jìn)入到腫瘤中。因?yàn)槎痰腞NA片段在沒有被直接注射的情況下無法進(jìn)入到腫瘤中，并且實(shí)驗(yàn)室用的注射方法在臨床中是不能適用的。

10/27/2022siRNA在卵巢癌癥治療的發(fā)現(xiàn)siRNA與癌癥治療的探究這研究組將能靶向一種促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞存活和擴(kuò)散的蛋白質(zhì)的siRNA轉(zhuǎn)載進(jìn)一種脂質(zhì)體（一種脂肪球，體積非常?。┲?。研究人員對(duì)感染了三種人類卵巢癌細(xì)胞系的小鼠進(jìn)行了3到5周的處理。這些小鼠接受了含有FAKsiRNA、對(duì)照siRNA或空處理。一些小鼠接受了siRNA脂質(zhì)體和化療藥物docetaxel。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，接受了FAK沉默脂質(zhì)體的小鼠的腫瘤重量與對(duì)照組相比，減少了44％－72％；聯(lián)合使用了FAK沉默脂質(zhì)體和藥物docetaxel的小鼠，其腫瘤腫瘤減少了94％－98％。而且這種聯(lián)合方法對(duì)docetaxel抗性卵巢癌細(xì)胞系同樣有用。

10/27/2022siRNA與癌癥治療的探究10/27/2022武漢大學(xué)中南醫(yī)院胃腸科教授鄧長生在InternationalImmunopharmacology上發(fā)表RNAi文章，解析以siRNA治療胃癌的新成果。胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在癌癥致死原因中列第二。武大中南醫(yī)院鄧長生教授、夏冰教授等在先前的研究中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)易感基因，與湖北漢族人胃癌顯著相關(guān)，尤其是在湖北漢族人群腫瘤壞死因子基因位點(diǎn)上，檢測(cè)出一新的等位基因，為胃癌的早期診斷和治療提供了一項(xiàng)新方法。找到靶位基因后，鄧長生教授等嘗試用最新的RNAi技術(shù)治療胃癌。鄧教授研究小組以survivin為靶位設(shè)計(jì)siRNA，構(gòu)建了一個(gè)Psilencer2.1-surivinsiRNA質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒導(dǎo)入胃癌MGC-803細(xì)胞系中，同時(shí)還將該細(xì)胞系注入裸鼠體內(nèi)，觀察該siRNA的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠細(xì)胞內(nèi)的surivin基因轉(zhuǎn)錄的mRNA量顯著下降，并且surivin蛋白表達(dá)量也下降，癌細(xì)胞凋亡率升高。總的來說，該siRNA靶位可有效的抑制胃癌細(xì)胞增殖，可能成為胃癌的潛在治療靶位。siRNA在胃癌癥治療的發(fā)現(xiàn)siRNA與癌癥治療的探究10/27/2022Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，Survivin具有腫瘤特異性，只表達(dá)于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細(xì)胞的分化增殖及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Survivin是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，Survivin功能復(fù)雜，具有抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并且參與細(xì)胞的有絲分裂、血管的生成和腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生等作用。目前，Survivin已成為研究的熱點(diǎn)。Survivin在人類各種腫瘤組織癌細(xì)胞中含量很豐富，但在正常細(xì)胞中卻幾乎不存在。體內(nèi)外研究表明，Survivin可在多種轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中表達(dá)，并見于所有人類最常見的腫瘤組織，包括肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌。Survivin蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)siRNA與癌癥治療的探究靶向survivin的siRNA對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞增殖的影響

設(shè)計(jì)并合成3條靶向survivin的小分子干擾RNA(siRNA),構(gòu)建表達(dá)性干擾RNA質(zhì)粒(shRNA)shRNAsurvivin-1、shRNA-survivin-2和shRNA-survivin-3,分別轉(zhuǎn)染胃癌BGC-823細(xì)胞,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)干擾RNA沉默survivinmRNA表達(dá)效果,Westernblot觀察對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞survivin蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制,MTT(四甲基偶氮唑鹽)比色法分析檢測(cè)細(xì)胞生長抑制率,流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期和凋亡率,探討干擾RNA對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞生長的影響。10/27/2022siRNA與癌癥治療的探究結(jié)果在體外,shRNA-survivin-1有效沉默人胃癌BGC-823細(xì)胞survivinmRNA的表達(dá),使survivinmRNA相對(duì)水平明顯降低(P<0.05),survivin蛋白質(zhì)表達(dá)抑制,72h細(xì)胞生長抑制率達(dá)74.92%(P<0.05),shRNA-survivin-1使G2/M期細(xì)胞百分比明顯增加,凋亡率顯著增加(P<0.05)。

結(jié)論shRNA-survivin-1可以沉默survivin基因的表達(dá),可以顯著抑制胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖,在一定程度上誘導(dǎo)其自發(fā)凋亡。10/27/2022siRNA與癌癥治療的探究