實驗七、兔腎原代細胞的分離與培養(yǎng)課件

兔腎原代細胞的分離與培養(yǎng)岳續(xù)朋2013-12-27如何獲得體外培養(yǎng)的細胞肺癌A549結腸癌colo320人腎上皮細胞293T肝癌HepG2原代培養(yǎng)是從供體取得細胞、組織或器官后在體外進行首次培養(yǎng)直至成功地進行首次傳代之前的培養(yǎng)。因此，較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細胞保持原有細胞的基本性質，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數。但實際上，通常把第一代至第十代以內的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞。

試劑75%乙醇PBS緩沖液（pH7.2）D-HanKs液（無鈣鎂離子）消化液（0.5%胰蛋白酶、0.02%EDTA1:1混合）0.4%臺酚藍RPMI-1640培養(yǎng)基(酚紅指示劑)原代培養(yǎng)方法流程圖組織塊培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法處死取材接種培養(yǎng)剪切清洗消化計數培養(yǎng)處死取材剪切清洗組織塊培養(yǎng)法動物處死取新生的家兔（出生2-3天）一只，用頸椎脫臼將其處死，浸入盛有75%乙醇的燒杯中5-10秒鐘，然后取出放在解剖平皿中送入超凈工作臺。取材用碘酒和75%的乙醇再次消毒一次，打開消毒器械包，用鑷子扯開腹部皮膚，用解剖剪剪開腹腔，暴露腹腔臟器，用另一個鑷子夾起腸管翻向一側，暴露出位于腹腔背側脊柱兩側的腎臟（左高右低），將其取下，放于消毒的培養(yǎng)皿中。組織塊培養(yǎng)法剪切剪開腎膜，剝向腎門，去除腎膜，用吸管吸取滅菌PBS（HnaKs液）將腎臟清洗3次，去除血污；將腎臟移入另一平皿中，將腎沿縱軸切開，減去腎盂，用眼科剪將腎組織反復剪切，直至0.5-1mm3組織塊。清洗剪切后的組織塊再用滅菌的PBS（HanKs液）沖洗數次，直到PBS澄清為止。消化培養(yǎng)法處死動物、取材、剪切以及組織塊的清洗都與組織塊培養(yǎng)法相同。將組織塊移入無菌的離心管中，靜置數分鐘，使組織塊自然沉降到管底，棄上清。消化及分散組織塊向盛有組織塊的離心管中加入含EDTA的0.25%的胰蛋白酶，體積約為組織塊體積的5-8倍，與組織塊混勻后，置于37℃的水浴槽中消化10-20分鐘，其間每隔5分鐘搖動一次。當組織塊變得疏松、顏色發(fā)白時，從水浴槽中取出離心管，加入2-3ml培養(yǎng)基，終止消化，用吸管反復吹打，直到大部分組織塊分散成單細胞或細胞團狀態(tài)為止，1000rpm離心5分鐘，棄去上清，再加入新鮮的培養(yǎng)基。將此細胞懸液用100目、200目的不銹鋼濾網過濾至燒杯中。消化培養(yǎng)法觀察接種培養(yǎng)后要每天觀察培養(yǎng)基是否污染，染色變化以及細胞生長狀況。培養(yǎng)基呈