雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗(yàn)原理及其操作演示

雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗(yàn)原理及其操作演示演示實(shí)驗(yàn)（一）.接受抗原刺激后，能分泌針對(duì)該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。B淋巴細(xì)胞本身是一種終末分化細(xì)胞，通常不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一段時(shí)間后便會(huì)死亡——短命細(xì)胞一、雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的3個(gè)技術(shù)關(guān)鍵1.B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的特性：B淋巴細(xì)胞(Blymphocytes)：.骨髓瘤細(xì)胞(myelomacells):惡性增殖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，只要營(yíng)養(yǎng)條件適合可永遠(yuǎn)分裂和存活——長(zhǎng)命細(xì)胞。經(jīng)篩選與馴化，現(xiàn)已建立多種骨髓瘤細(xì)胞株——沒(méi)有抗體分泌物。.2.細(xì)胞融合技術(shù)：脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)命不分泌抗體分泌抗體短命分泌抗體長(zhǎng)命K?hler和Milstein,19751984年Nobel醫(yī)學(xué)獎(jiǎng).3.雜交瘤細(xì)胞的篩選：脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞脾細(xì)胞/脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞/骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞脾細(xì)胞篩選出不能長(zhǎng)期存活不能長(zhǎng)期存活.HAT培養(yǎng)基篩選H,次黃嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA內(nèi)源性途徑(主要途徑)谷氨酰胺or單磷酸尿苷酸二氫葉酸還原酶AHT外源性途徑(旁路途徑)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

(HGPRT

)胸腺嘧啶激酶

(TK)(Thymidinekinase)B淋巴細(xì)胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤細(xì)胞：HGPRT-，

TK-存活死亡外源性途徑(旁路途徑).二、雜交瘤技術(shù)的操作流程1.動(dòng)物免疫：目的：在細(xì)胞融合后獲得盡可能多的分泌針對(duì)于該目標(biāo)抗原的特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞.特定目標(biāo)抗原動(dòng)物免疫脾臟中B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞大量增殖刺激能分泌針對(duì)于該抗原的特異性抗體.常規(guī)免疫法脾內(nèi)一次性免疫法短程免疫法體外免疫法常用免疫方法：“穩(wěn)妥；優(yōu)勢(shì)克隆”皮下注射腹腔注射靜脈注射免疫途徑：“省時(shí)；省抗原”“省時(shí)”“操作繁瑣”.常規(guī)免疫法：第1次免疫：抗原+福氏完全佐劑第2次免疫：抗原+福氏不完全佐劑第3次免疫：抗原+不加佐劑第4次免疫：抗原+不加佐劑(皮下注射或靜脈注射)(皮下注射)(皮下注射)(靜脈注射).二、細(xì)胞融合及HAT篩選病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合電激融合1、細(xì)胞融合方法：.細(xì)胞懸液的制備與融合(1)脾細(xì)胞懸液的制備：最后一次免疫后第3天制備

(2)骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備：于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期制備(3)細(xì)胞融合：50%PEG(1000~4000),pH8.0,38oC,1min.2、HAT培養(yǎng)基的篩選融合后細(xì)胞混合液HAT培養(yǎng)基2weekslaterHT培養(yǎng)基正常培養(yǎng)基1weeklater.三、抗體的檢測(cè)要求：

簡(jiǎn)便、快速、敏感;在短時(shí)間內(nèi)能檢測(cè)大量樣品常用方法：酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)間接免疫熒光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)雙相擴(kuò)散法.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗體酶第2抗體待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液底物有色產(chǎn)物酶標(biāo)儀檢測(cè)技術(shù)原理：.四、克隆化常用克隆化方法：有限稀釋法軟瓊脂平板法顯微操作法80個(gè)細(xì)胞/96孔飼養(yǎng)細(xì)胞(feedercells)ELISA法檢測(cè)單克隆雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特異性抗體的陽(yáng)性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體。.由單一克隆的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體，只針對(duì)于一個(gè)抗原決定簇——單克隆抗體(monoclonalantibody,MAb)單克隆抗體(monoclonalantibody,MAb)單克隆抗體優(yōu)點(diǎn)：高度純一高度專(zhuān)一應(yīng)用：疾病的論斷和治療(生物導(dǎo)彈)生物大分子的鑒定、定位和分離純化細(xì)胞器的鑒定、定位和分離特定細(xì)胞或病毒的鑒定、定位和分離.五、大規(guī)模培養(yǎng)——批量生產(chǎn)單克隆抗體常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法：動(dòng)物接種法轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)罐法.培養(yǎng)上清中X抗體的檢測(cè)克隆化培養(yǎng)單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞可持續(xù)分泌單克隆抗體規(guī)模化培養(yǎng)獲得大量單克隆抗體動(dòng)物免疫細(xì)胞融合混合細(xì)胞的HAT篩選)分泌X抗體B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞X抗原B淋巴細(xì)胞瘤的突變株培養(yǎng)數(shù)天