藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)課件

藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)趙娣中國(guó)藥科大學(xué)藥代研究中心2012年10月16日藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)趙娣神農(nóng)嘗百草

傳說(shuō)神農(nóng)一生下來(lái)就是個(gè)“水晶肚”，幾乎是全透明的，五臟六腑全都能看得見(jiàn)，還能看得見(jiàn)吃進(jìn)去的東西。那時(shí)候，人們經(jīng)常因亂吃東西而生病，甚至喪命。神農(nóng)為此決心嘗遍百草，能吃的放在身體左邊的袋子里，介紹給別人吃；不好吃的就放在身體右邊袋子里，作藥用。不能吃的就提醒人們注意。2-神農(nóng)嘗百草傳說(shuō)神農(nóng)一生下來(lái)就是個(gè)“水晶肚”，幾乎生物樣品藥物代謝動(dòng)力學(xué)定量研究藥物（包括外來(lái)化學(xué)物質(zhì)）在生物體內(nèi)吸收、分布、排泄和代謝（簡(jiǎn)稱(chēng)體內(nèi)過(guò)程）規(guī)律的一門(mén)學(xué)科。常用測(cè)定方法

HPLC-UV?GC-MS?LC-MS/MS?數(shù)據(jù)處理分析3-生物樣品藥物代謝動(dòng)力學(xué)定量研究藥物（包括外來(lái)化學(xué)物質(zhì)）在生物1.HPLC原理與標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3.樣品處理與方法開(kāi)發(fā)4.定性定量與分析測(cè)定5.數(shù)據(jù)處理與藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算6.實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)安排靜注加替沙星在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究4-1.HPLC原理與標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)實(shí)驗(yàn)安排靜注加替沙星HPLC原理與標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)1.HPLC的組成2.分配色譜的原理3.色譜柱4.流動(dòng)相5.定性與定量方法6.樣品的預(yù)處理7.反相色譜分析方法的開(kāi)發(fā)5-HPLC原理與標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)1.HPLC的組成5-

HighPerformanceLiquidChromatography

HPLC的組成

Pump泵

Injector/Autosampler進(jìn)樣器/自動(dòng)進(jìn)樣器

Column色譜柱

Detector檢測(cè)器

DataSystem/Integrator數(shù)據(jù)系統(tǒng)/積分儀表6-

HighPerformanceLiquidChro高效液相色譜系統(tǒng)7-高效液相色譜系統(tǒng)7-高效液相色譜系統(tǒng)SHIMADZULCMS-2010EVLC-MS/MSThermoTSQQuantumAccess8-高效液相色譜系統(tǒng)SHIMADZULCMS-2010EVLC分配色譜的分離機(jī)理9-分配色譜的分離機(jī)理9-分配色譜概述反相色譜的主要類(lèi)型，基于分子的極性分離洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫常用的流動(dòng)相：有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，水應(yīng)用添加劑，成為離子對(duì)、離子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)反相色譜固定相多為鍵合相10-分配色譜概述反相色譜的主要類(lèi)型，基于分子的極性分離10-對(duì)HPLC柱的了解色譜柱分類(lèi)填料，含碳量，基質(zhì)，粒徑色譜柱的應(yīng)用正相柱，反相柱，預(yù)處理柱色譜柱的規(guī)格島津ShimadzuVP-ODS;150L×2.0;5μm;柱號(hào)8082693.11-對(duì)HPLC柱的了解色譜柱分類(lèi)11-鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上，作為固定相。優(yōu)點(diǎn)∶固定相穩(wěn)定，不易流失應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑消除硅羥基的不良影響缺點(diǎn)∶pH值不能小于3同樣填料，各種牌號(hào)色譜柱不盡相同12-鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺反相C18色譜柱的活化步驟一：90%甲醇1mL/min流速?zèng)_洗30min步驟二：10%甲醇1mL/min流速?zèng)_洗30min步驟三：90%甲醇1mL/min流速?zèng)_洗60min13-反相C18色譜柱的活化步驟一：13-色譜柱的存放存放前的處理除去雜質(zhì)、鹽合適的存放溶劑避免色譜柱床的干枯避免機(jī)械震動(dòng)防止細(xì)菌生長(zhǎng)注意存放的溫度14-色譜柱的存放存放前的處理14-液相色譜對(duì)流動(dòng)相的要求除色譜柱對(duì)流動(dòng)相對(duì)的要求外，還有∶與檢測(cè)器匹配脫氣避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度細(xì)菌的生長(zhǎng)15-液相色譜對(duì)流動(dòng)相的要求除色譜柱對(duì)流動(dòng)相對(duì)的要求外，還有∶15流動(dòng)相的脫氣流動(dòng)相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動(dòng)減小保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測(cè)的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化16-流動(dòng)相的脫氣流動(dòng)相脫氣的目的16-流動(dòng)相脫氣的方法加熱簡(jiǎn)單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動(dòng)相組成的變化抽真空同上，一般在溶劑抽濾的同時(shí)，也有脫氣的效果超聲波簡(jiǎn)單，但效果不理想。通惰性氣體（一般用氦氣）可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度脫氣機(jī)可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度17-流動(dòng)相脫氣的方法加熱17-色譜峰定性鑒別每個(gè)色譜峰通過(guò)比較保留值(通常是保留時(shí)間)的方法，找到各色譜峰所對(duì)應(yīng)的組份大多數(shù)情況下用比較保留時(shí)間來(lái)定性 即所謂：保留時(shí)間相同，可能是同樣的組份保留時(shí)間不同，肯定不是同樣的組份18-色譜峰定性鑒別每個(gè)色譜峰18-用保留時(shí)間定性用“標(biāo)樣”的保留值定出被測(cè)組份的位置19-用保留時(shí)間定性用“標(biāo)樣”的保留值定出被測(cè)組份的位置19-標(biāo)準(zhǔn)加入法舉例

廢水樣品中五氯苯（PCP）的分析PCP4ppm3ppm2ppm1ppm20-標(biāo)準(zhǔn)加入法舉例廢水樣品中五氯苯（PCP）的分析PCP4p常用的定量方法峰面積百分比法由于檢測(cè)技術(shù)的影響，在液相色譜中不常用外標(biāo)法在液相色譜中用的最多內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確，但是麻煩在標(biāo)準(zhǔn)方法中用的最多21-常用的定量方法峰面積百分比法21-外標(biāo)法定量配制一系列已知濃度的標(biāo)樣22-外標(biāo)法定量配制一系列已知濃度的標(biāo)樣22-外標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線23-外標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線23-內(nèi)標(biāo)法定量（一）配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣24-內(nèi)標(biāo)法定量（一）配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣24-內(nèi)標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線25-內(nèi)標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線25-內(nèi)標(biāo)法定量（三）對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測(cè)組分相似(同系物、異構(gòu)體)在樣品中不存在不與樣品中組份發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)保留值與待測(cè)組分接近濃度（響應(yīng)值）與待測(cè)組分相當(dāng)其色譜峰與其他色譜峰分離好26-內(nèi)標(biāo)法定量（三）對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求26-可接收的檢測(cè)范圍校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)有效，高或低于這些點(diǎn)都可能引起計(jì)算錯(cuò)誤27-可接收的檢測(cè)范圍校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)有效，樣品的預(yù)處理樣品預(yù)處理的目的除去微粒減少干擾雜質(zhì)濃縮微量的組份提高檢測(cè)的靈敏度及選擇性改善分離的效果有利于色譜柱及儀器的保護(hù)28-樣品的預(yù)處理樣品預(yù)處理的目的28-樣品的預(yù)處理重要性占樣品分析時(shí)間的比例樣品預(yù)處理所用時(shí)間遠(yuǎn)大于色譜分離的時(shí)間占分析的消耗總成本最大消耗大量的溶劑及其他化學(xué)品實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的最重要因素

是決定性的步驟29-樣品的預(yù)處理重要性占樣品分析時(shí)間的比例29-樣品預(yù)處理常用的方法高速離心過(guò)濾、超濾選擇性沉淀衍生反應(yīng)液-固萃取/液-液萃取

Sep-Pak樣品處理小柱其他30-樣品預(yù)處理常用的方法高速離心30-選擇性沉淀常用于生化樣品中除蛋白有機(jī)溶劑乙腈，甲醇強(qiáng)酸三氯乙酸，過(guò)氯酸鹽50%硫酸銨10%TCA31-選擇性沉淀常用于生化樣品中除蛋白31-樣品分析時(shí)第一步干什么?想辦法得到各種信息向同行了解是否做過(guò)此類(lèi)樣品，或有否類(lèi)似樣品的分析方法查文獻(xiàn)，如CA(化學(xué)文摘)儀器制造商的文獻(xiàn)，如Waters對(duì)色譜柱有足夠的了解掌握分離機(jī)理，自己開(kāi)發(fā)方法充分了解您自己的樣品32-樣品分析時(shí)第一步干什么?想辦法得到各種信息32-分析時(shí)要了解哪方面的情況？靈敏度的要求有多高?樣品的本底是否很復(fù)雜?有多少組份要分析?對(duì)分析的精確度、準(zhǔn)確度等有多高要求?是否因是日常檢驗(yàn)，而要求方法容易使用?33-分析時(shí)要了解哪方面的情況？靈敏度的要求有多高?33-使用文獻(xiàn)方法色譜柱填料的種類(lèi)、品牌是否相同?注意文獻(xiàn)方法的流動(dòng)相是否損害色譜柱?如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動(dòng)相注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長(zhǎng)需要調(diào)整流速、進(jìn)樣量注意梯度條件了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）34-使用文獻(xiàn)方法色譜柱填料的種類(lèi)、品牌是否相同?34-反相色譜的方法開(kāi)發(fā)開(kāi)發(fā)過(guò)程實(shí)例色譜條件∶色譜柱：C18，4mm×30mm流動(dòng)相：乙腈/水，不同的溶劑強(qiáng)度，60/40、50/50、40/60，由強(qiáng)漸弱流速：2ml/min樣品：①對(duì)羥基苯甲酸甲酯(MethylParaben)②對(duì)羥基苯甲酸丙酯(PropylParaben)③對(duì)羥基苯甲酸丁酯(ButylParaben)35-反相色譜的方法開(kāi)發(fā)開(kāi)發(fā)過(guò)程實(shí)例35-改變流動(dòng)相比例譜圖36-改變流動(dòng)相比例譜圖36-改變流動(dòng)相組成通過(guò)改變流動(dòng)相改變選擇性同樣強(qiáng)度的不同溶劑改變色譜柱37-改變流動(dòng)相組成通過(guò)改變流動(dòng)相改變選擇性37-離子型化合物的分離方式使用離子交換柱∶離子交換法主要用于“強(qiáng)”陰、陽(yáng)離子使用反相柱離子抑制色譜法通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值，使樣品成中性離子對(duì)色譜法加入“對(duì)離子”，使樣品呈中性38-離子型化合物的分離方式使用離子交換柱∶離子交換法38-離子抑制色譜離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動(dòng)相的pH值，抑制樣品離子的電離適用于弱酸性化合物的分離降低流動(dòng)相的pH值，使樣品降低離子化使用硅膠基質(zhì)C18填料使用條件應(yīng)在填料基質(zhì)的范圍內(nèi)硅膠柱的pH在2-8（較保險(xiǎn)值3-7）內(nèi)39-離子抑制色譜離子型化合物在反相色譜柱上不保留39-常用緩沖液及其pH值40-常用緩沖液及其pH值40-離子抑制色譜實(shí)例在乙腈/水及pH=7時(shí)，

多數(shù)保留時(shí)間很短，無(wú)

法完全分離。41-離子抑制色譜實(shí)例在乙腈/水及pH=7時(shí)，

多數(shù)保留時(shí)間很短，其他精密儀器操作標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)要點(diǎn)高速冷凍離心機(jī)：配平、十字交叉、樣品選擇普通離心機(jī)：配平、十字交叉、樣品選擇萬(wàn)分之一電子天平：稱(chēng)量量程范圍、記錄、保養(yǎng)紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：預(yù)熱、樣品量、校準(zhǔn)渦旋振蕩器：渦旋程度超聲機(jī)：超聲效果、時(shí)間42-其他精密儀器操作標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)要點(diǎn)高速冷凍離心機(jī)：配藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)室的要求1.環(huán)境的要求：灰塵、濕度、陽(yáng)光是分析儀器的大敵2.所寫(xiě)即所做3.分析測(cè)定用試劑為色譜純及以上，水為超純水4.痕量分析對(duì)實(shí)驗(yàn)人員有較高要求5.對(duì)儀器設(shè)備的操作嚴(yán)格按照SOP執(zhí)行，專(zhuān)人管理和維護(hù)保養(yǎng)6.良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣43-藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)室的要求1.環(huán)境的要求：灰塵、濕度、陽(yáng)光是分析HPLC-UV測(cè)定加替沙星的血藥濃度如何著手？查文獻(xiàn)：中國(guó)優(yōu)秀期刊論文數(shù)據(jù)庫(kù)、pubmed需要關(guān)注的問(wèn)題：色譜柱的選擇流動(dòng)相的組成柱溫箱的溫度樣品處理方法檢測(cè)器的波長(zhǎng)定量下限和標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍

44-HPLC-UV測(cè)定加替沙星的血藥濃度如何著手？查文獻(xiàn)：中國(guó)優(yōu)靜注加替沙星在家兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)如何著手？查文獻(xiàn)：中國(guó)優(yōu)秀期刊論文數(shù)據(jù)庫(kù)、pubmed實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要考慮的問(wèn)題：種屬給藥劑量取血時(shí)間采樣量血藥濃度大概范圍45-靜注加替沙星在家兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)如何著手？查文獻(xiàn)：中國(guó)優(yōu)秀期謝謝！謝謝！藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)趙娣中國(guó)藥科大學(xué)藥代研究中心2012年10月16日藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)趙娣神農(nóng)嘗百草

傳說(shuō)神農(nóng)一生下來(lái)就是個(gè)“水晶肚”，幾乎是全透明的，五臟六腑全都能看得見(jiàn)，還能看得見(jiàn)吃進(jìn)去的東西。那時(shí)候，人們經(jīng)常因亂吃東西而生病，甚至喪命。神農(nóng)為此決心嘗遍百草，能吃的放在身體左邊的袋子里，介紹給別人吃；不好吃的就放在身體右邊袋子里，作藥用。不能吃的就提醒人們注意。48-神農(nóng)嘗百草傳說(shuō)神農(nóng)一生下來(lái)就是個(gè)“水晶肚”，幾乎生物樣品藥物代謝動(dòng)力學(xué)定量研究藥物（包括外來(lái)化學(xué)物質(zhì)）在生物體內(nèi)吸收、分布、排泄和代謝（簡(jiǎn)稱(chēng)體內(nèi)過(guò)程）規(guī)律的一門(mén)學(xué)科。常用測(cè)定方法

HPLC-UV?GC-MS?LC-MS/MS?數(shù)據(jù)處理分析49-生物樣品藥物代謝動(dòng)力學(xué)定量研究藥物（包括外來(lái)化學(xué)物質(zhì)）在生物1.HPLC原理與標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3.樣品處理與方法開(kāi)發(fā)4.定性定量與分析測(cè)定5.數(shù)據(jù)處理與藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算6.實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)安排靜注加替沙星在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究50-1.HPLC原理與標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)實(shí)驗(yàn)安排靜注加替沙星HPLC原理與標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)1.HPLC的組成2.分配色譜的原理3.色譜柱4.流動(dòng)相5.定性與定量方法6.樣品的預(yù)處理7.反相色譜分析方法的開(kāi)發(fā)51-HPLC原理與標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)1.HPLC的組成5-

HighPerformanceLiquidChromatography

HPLC的組成

Pump泵

Injector/Autosampler進(jìn)樣器/自動(dòng)進(jìn)樣器

Column色譜柱

Detector檢測(cè)器

DataSystem/Integrator數(shù)據(jù)系統(tǒng)/積分儀表52-

HighPerformanceLiquidChro高效液相色譜系統(tǒng)53-高效液相色譜系統(tǒng)7-高效液相色譜系統(tǒng)SHIMADZULCMS-2010EVLC-MS/MSThermoTSQQuantumAccess54-高效液相色譜系統(tǒng)SHIMADZULCMS-2010EVLC分配色譜的分離機(jī)理55-分配色譜的分離機(jī)理9-分配色譜概述反相色譜的主要類(lèi)型，基于分子的極性分離洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫常用的流動(dòng)相：有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，水應(yīng)用添加劑，成為離子對(duì)、離子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)反相色譜固定相多為鍵合相56-分配色譜概述反相色譜的主要類(lèi)型，基于分子的極性分離10-對(duì)HPLC柱的了解色譜柱分類(lèi)填料，含碳量，基質(zhì)，粒徑色譜柱的應(yīng)用正相柱，反相柱，預(yù)處理柱色譜柱的規(guī)格島津ShimadzuVP-ODS;150L×2.0;5μm;柱號(hào)8082693.57-對(duì)HPLC柱的了解色譜柱分類(lèi)11-鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上，作為固定相。優(yōu)點(diǎn)∶固定相穩(wěn)定，不易流失應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑消除硅羥基的不良影響缺點(diǎn)∶pH值不能小于3同樣填料，各種牌號(hào)色譜柱不盡相同58-鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺反相C18色譜柱的活化步驟一：90%甲醇1mL/min流速?zèng)_洗30min步驟二：10%甲醇1mL/min流速?zèng)_洗30min步驟三：90%甲醇1mL/min流速?zèng)_洗60min59-反相C18色譜柱的活化步驟一：13-色譜柱的存放存放前的處理除去雜質(zhì)、鹽合適的存放溶劑避免色譜柱床的干枯避免機(jī)械震動(dòng)防止細(xì)菌生長(zhǎng)注意存放的溫度60-色譜柱的存放存放前的處理14-液相色譜對(duì)流動(dòng)相的要求除色譜柱對(duì)流動(dòng)相對(duì)的要求外，還有∶與檢測(cè)器匹配脫氣避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度細(xì)菌的生長(zhǎng)61-液相色譜對(duì)流動(dòng)相的要求除色譜柱對(duì)流動(dòng)相對(duì)的要求外，還有∶15流動(dòng)相的脫氣流動(dòng)相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動(dòng)減小保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測(cè)的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化62-流動(dòng)相的脫氣流動(dòng)相脫氣的目的16-流動(dòng)相脫氣的方法加熱簡(jiǎn)單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動(dòng)相組成的變化抽真空同上，一般在溶劑抽濾的同時(shí)，也有脫氣的效果超聲波簡(jiǎn)單，但效果不理想。通惰性氣體（一般用氦氣）可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度脫氣機(jī)可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度63-流動(dòng)相脫氣的方法加熱17-色譜峰定性鑒別每個(gè)色譜峰通過(guò)比較保留值(通常是保留時(shí)間)的方法，找到各色譜峰所對(duì)應(yīng)的組份大多數(shù)情況下用比較保留時(shí)間來(lái)定性 即所謂：保留時(shí)間相同，可能是同樣的組份保留時(shí)間不同，肯定不是同樣的組份64-色譜峰定性鑒別每個(gè)色譜峰18-用保留時(shí)間定性用“標(biāo)樣”的保留值定出被測(cè)組份的位置65-用保留時(shí)間定性用“標(biāo)樣”的保留值定出被測(cè)組份的位置19-標(biāo)準(zhǔn)加入法舉例

廢水樣品中五氯苯（PCP）的分析PCP4ppm3ppm2ppm1ppm66-標(biāo)準(zhǔn)加入法舉例廢水樣品中五氯苯（PCP）的分析PCP4p常用的定量方法峰面積百分比法由于檢測(cè)技術(shù)的影響，在液相色譜中不常用外標(biāo)法在液相色譜中用的最多內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確，但是麻煩在標(biāo)準(zhǔn)方法中用的最多67-常用的定量方法峰面積百分比法21-外標(biāo)法定量配制一系列已知濃度的標(biāo)樣68-外標(biāo)法定量配制一系列已知濃度的標(biāo)樣22-外標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線69-外標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線23-內(nèi)標(biāo)法定量（一）配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣70-內(nèi)標(biāo)法定量（一）配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣24-內(nèi)標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線71-內(nèi)標(biāo)法定量（二）實(shí)際色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線25-內(nèi)標(biāo)法定量（三）對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測(cè)組分相似(同系物、異構(gòu)體)在樣品中不存在不與樣品中組份發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)保留值與待測(cè)組分接近濃度（響應(yīng)值）與待測(cè)組分相當(dāng)其色譜峰與其他色譜峰分離好72-內(nèi)標(biāo)法定量（三）對(duì)內(nèi)標(biāo)物的要求26-可接收的檢測(cè)范圍校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)有效，高或低于這些點(diǎn)都可能引起計(jì)算錯(cuò)誤73-可接收的檢測(cè)范圍校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范圍內(nèi)有效，樣品的預(yù)處理樣品預(yù)處理的目的除去微粒減少干擾雜質(zhì)濃縮微量的組份提高檢測(cè)的靈敏度及選擇性改善分離的效果有利于色譜柱及儀器的保護(hù)74-樣品的預(yù)處理樣品預(yù)處理的目的28-樣品的預(yù)處理重要性占樣品分析時(shí)間的比例樣品預(yù)處理所用時(shí)間遠(yuǎn)大于色譜分離的時(shí)間占分析的消耗總成本最大消耗大量的溶劑及其他化學(xué)品實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的最重要因素

是決定性的步驟75-樣品的預(yù)處理重要性占樣品分析時(shí)間的比例29-樣品預(yù)處理常用的方法高速離心過(guò)濾、超濾選擇性沉淀衍生反應(yīng)液-固萃取/液-液萃取

Sep-Pak樣品處理小柱其他76-樣品預(yù)處理常用的方法高速離心30-選擇性沉淀常用于生化樣品中除蛋白有機(jī)溶劑乙腈，甲醇強(qiáng)酸三氯乙酸，過(guò)氯酸鹽50%硫酸銨10%TCA77-選擇性沉淀常用于生化樣品中除蛋白31-樣品分析時(shí)第一步干什么?想辦法得到各種信息向同行了解是否做過(guò)此類(lèi)樣品，或有否類(lèi)似樣品的分析方法查文獻(xiàn)，如CA(化學(xué)文摘)儀器制造商的文獻(xiàn)，如Waters對(duì)色譜柱有足夠的了解掌握分離機(jī)理，自己開(kāi)發(fā)方法充分了解您自己的樣品78-樣品分析時(shí)第一步干什么?想辦法得到各種信息32-分析時(shí)要了解哪方面的情況？靈敏度的要求有多高?樣品的本底是否很復(fù)雜?有多少組份要分析?對(duì)分析的精確度、準(zhǔn)確度等有多高要求?是否因是日常檢驗(yàn)，而要求方法容易使用?79-分析時(shí)要了解哪方面的情況？靈敏度的要求有多高?33-使用文獻(xiàn)方法色譜柱填料的種類(lèi)、品牌是否相同?注意文獻(xiàn)方法的流動(dòng)相是否損害色譜柱?如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動(dòng)相注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長(zhǎng)需要調(diào)整流速、進(jìn)樣量注意梯度條件了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）80-使用文獻(xiàn)方法色譜柱填料的種類(lèi)、品牌是否相同?34-反相色譜的方法開(kāi)發(fā)開(kāi)發(fā)過(guò)程實(shí)例色譜條件∶色譜柱：C18，4mm×30mm流動(dòng)相：乙腈/水，不同的溶劑強(qiáng)度，60/40、50/50、40/60，由強(qiáng)漸弱流速：2ml/min樣品：①對(duì)羥基苯甲酸甲酯(MethylParaben)②對(duì)羥基苯甲酸丙酯(PropylParaben)③對(duì)羥基苯甲酸丁酯(ButylParaben)81-反相色譜的方法開(kāi)發(fā)開(kāi)發(fā)過(guò)程實(shí)例35-改變流動(dòng)相比例譜圖82-改變流動(dòng)相比例譜圖36-改變流動(dòng)相組成通過(guò)改變流動(dòng)相改變選擇性同樣強(qiáng)度的不同溶劑改變色譜柱83-改變流動(dòng)相組成通過(guò)改變流動(dòng)相改變選擇性37-離子型化合物的分離方式使用離子交換柱∶離子交換法主要用于“強(qiáng)”陰、陽(yáng)離子使用反相柱離子抑制色譜法通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值，使樣品成中性離子對(duì)色譜法加入“對(duì)離子”，使樣品呈中性84-離子型化合物的分離方式使用離子交換柱∶離子交換法38-離子抑制色譜離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動(dòng)相的pH值，抑制樣品離子的電離